Introduction
L'étude du développement des ovules non fécondés chez les amphibiens offre un aperçu fascinant des mécanismes fondamentaux de la reproduction et du développement embryonnaire. Cet article explore les aspects morphologiques de l'ovocyte primaire, les processus de maturation et de fécondation chez les amphibiens, et les différentes étapes du développement embryonnaire précoce.
Aspects morphologiques de l'ovocyte primaire
Ovogenèse et croissance de l'ovocyte
L'ovogenèse débute par une période d'activité mitotique intense des ovogonies, assurant le renouvellement des ovocytes. L'ovogonie entre ensuite dans une phase d'accroissement, augmentant considérablement de taille, passant de quelques microns à environ 1,2 millimètre de diamètre. À ce stade, elle devient un ovocyte primaire ovarien, bloqué en diplotène de la prophase de la première division de méiose.
Reprise de la méiose et formation de l'ovotide
Le stimulus hormonal de la maturation déclenche la reprise de la première division de méiose, aboutissant à l'expulsion du premier globule polaire. L'ovocyte secondaire ainsi formé est ovulé puis pondu, et reste bloqué à son tour au stade de la métaphase de la deuxième division de méiose. La fécondation est l'événement qui initie la reprise et la fin de la méiose de l'ovocyte secondaire, avec l'émission du deuxième globule polaire. L'ovotide haploïde est alors un stade transitoire, car la fécondation rétablit la diploïdie de l'espèce en fusionnant les pronuclei mâle et femelle dans l'heure qui suit.
Comparaison avec la spermatogenèse
Le principe de la méiose est le même pour la spermatogenèse et l'ovogenèse, c'est-à-dire la réduction chromatique formant des gamètes haploïdes. Cependant, alors que la spermatogenèse produit 4 spermatozoïdes à partir d'une spermatogonie, l'ovogenèse ne donne qu'un seul ovocyte à partir d'une ovogonie, ainsi que trois globules polaires qui ne contribuent pas à la reproduction.
Histologie des ovogonies
Du point de vue histologique, les cellules souches sont constituées par les ovogonies rassemblées en « nids d'ovogonies », où l'activité mitotique intense est synchrone. Il est donc fréquent d'observer des images multiples de stades de mitose, comme de nombreuses métaphases.
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Accumulation de réserves dans l'ovocyte d'amphibien
Les dimensions exceptionnelles de l'ovocyte d'amphibien sont dues à l'accumulation de réserves nutritionnelles et informatives. De plus, l'ovocyte produit et stocke de nombreuses protéines dites « de ménage », nécessaires à l'assemblage rapide des constituants cellulaires, des membranes plasmiques à la chromatine. En effet, les premières heures du développement embryonnaire sont marquées par une activité mitotique intense lors de la période de clivage.
Matériaux stockés dans l'ovocyte primaire
L'ovocyte primaire stocke des matériaux nutritionnels d'origine exogène, apportés par la circulation maternelle. Parmi ces matériaux, on trouve des protéines, notamment les vitellogénines, synthétisées par le foie de la mère et captées par les cellules folliculaires entourant l'ovocyte. Ces vitellogénines sont ensuite transformées par l'ovocyte, après déshydratation, en complexes phosphoglycolipoprotéiques.
L'ovocyte primaire stocke également du matériel d'origine endogène, permettant l'expression de l'information génétique. À maturité, cet ovocyte primaire possède un noyau volumineux excentré vers le côté. On trouve également du glycogène stocké autour des noyaux, des ribosomes, du réticulum endoplasmique et des lipides, tous répartis autour du noyau. L'ARN de tous types est également présent, réparti d'une certaine manière. L'ARN messager Vg code pour la synthèse de facteurs de développement du pôle ventral dans l'induction du mésoderme.
Libération de l'ovocyte et reprise de la méiose
L'ovocyte se libère de l'ovaire et est émis dans l'oviducte femelle. Il y a alors reprise de la première division méiotique, en métaphase I, avec production d'un globule polaire qui donnera un ovocyte II, lequel restera en métaphase II dans l'oviducte. Cet ovocyte s'entoure d'une gangue glycoprotéique (muqueuse) sécrétée durant le transport dans l'oviducte. Cette gangue a pour fonction de créer des conditions favorables à la fécondation, en apportant des ions tels que Ca2+ et Mg2+, et en protégeant les œufs de la déshydratation lorsqu'ils sont émis hors du cloaque. La composition de cette gangue varie selon les espèces d'amphibiens.
Fécondation chez les amphibiens
Fécondation externe chez les anoures
Chez les anoures, la fécondation est externe et doit avoir lieu dès l'émission des ovocytes par la femelle.
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Fécondation interne chez les urodèles
Chez les urodèles, la fécondation a lieu au niveau du cloaque de la femelle, sans organe copulateur. Le mâle émet un spermatophore (formation mucilagineuse) sur lequel sont agglutinés les spermatozoïdes. La monospermie est observée chez les anoures (un seul spermatozoïde pénètre), tandis que la polyspermie est présente chez les urodèles (5 ou 6 spermatozoïdes pénètrent, mais un seul fécondera le noyau).
Mécanisme de la fécondation
Le spermatozoïde perd son flagelle. L'acrosome se fixe sur un récepteur, traverse la membrane vitelline et, au contact de la membrane plasmique, provoque une dépolarisation de la membrane en modifiant son potentiel. Cette dépolarisation, qui dure quelques minutes, est suivie d'une repolarisation. Ce phénomène entraîne une libération de Ca2+ (provenant du réticulum endoplasmique lisse et des mitochondries) dans la région corticale de l'œuf. Ce Ca2+ permet la polymérisation des filaments d'actine (allongement de la cellule), ce qui amène à la surface des granules corticaux. Ces granules libèrent leur contenu par fusion de leur membrane (exocytose). Le gel formé dans l'espace périvitellin permet la rotation de l'œuf dans la demi-heure qui suit : c'est le premier phénomène d'activation externe. On observe la rotation d'équilibre, également appelée rotation de symétrisation, qui indique que l'embryon a délimité ses régions. Lorsque la fécondation est monospermique, le croissant gris apparaît toujours diamétralement opposé au point de pénétration du spermatozoïde. La future face dorsale n'est pas une région très déterminée. Le décollement de la membrane empêche la polyspermie.
Rôle des microtubules dans la rotation de symétrisation
Le déplacement des molécules nécessite l'initiation d'un mouvement et l'utilisation d'un support. Au cours de la rotation de symétrisation, on constate la formation d'un réseau de microtubules orientés parallèlement à la surface de l'œuf, servant de support au déplacement des déterminants moléculaires. Tout ceci plaide en faveur d'une localisation moléculaire différentielle déterminant la future face dorsale de l'embryon. L'injection de cytoplasme de la région du croissant gris sur la face ventrale d'un autre embryon induit un deuxième embryon (siamois).
Développement embryonnaire précoce
Segmentation et formation de la blastula
Le développement embryonnaire précoce est une phase de divisions cellulaires rapides, passant d'un œuf unicellulaire à une blastula (6 à 10 000 cellules). Le premier plan de division passe par l'axe pôle animal/pôle végétatif, dit méridien, et donne 2 blastomères égaux. Les cycles cellulaires se poursuivent rapidement, de manière synchrone jusqu'à la 10ème ou 12ème division, puis deviennent asynchrones. L'expression des gènes est maternelle : toutes les protéines synthétisées le sont à partir d'ARN maternel stocké. On observe l'apparition d'un asynchronisme des divisions cellulaires. Au départ, on a un stade morula, puis l'apparition d'une cavité de segmentation. Cette blastula synthétise des molécules. À la fin de la segmentation, les micromères (du pôle animal) forment la matrice extracellulaire qui permettra la suite des événements.
Gastrulation et formation des trois feuillets embryonnaires
La gastrulation est le processus par lequel les trois feuillets embryonnaires (ectoderme, mésoderme et endoderme) se mettent en place. Ces trois feuillets migrent et s'emboîtent pour former les couches fondamentales de l'embryon. Une encoche blastoporale apparaît sous l'emplacement du croissant gris. Cette invagination intéresse un peu d'endoblaste, la plaque précordale (pharynx), puis le cordomésoblaste, ainsi que le mésoblaste somitique et latéral. Lorsque la gastrulation est terminée, les lames mésodermiques droite et gauche ne se sont pas encore rejointes. D'un germe à deux ensembles cellulaires (pôle animal et pôle végétatif), on passe progressivement, au cours de la gastrulation, à trois ensembles cellulaires qui s'emboîtent les uns dans les autres pour donner trois feuillets fondamentaux.
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Neurulation et organogenèse
Le processus d'induction neurale se déroule pendant la gastrulation. Le cordomésoblaste entre en contact avec l'ectoderme et induit celui-ci en plaque neurale (neurectoderme). Au début de la neurulation, la plaque neurale se met en place. Des bourrelets neuraux s'épaississent, se soulèvent puis se soudent pour former le tube neural. La fermeture se fait d'abord dans la région du tronc, puis dans celle de la queue (région caudale) et enfin, dans la région antérieure. Ce tube nerveux donnera l'encéphale et la moelle épinière.
Pendant que se déroule la neurulation, on assiste à une régionalisation du mésoblaste en lame cellulaire pleine formant la voûte et les parois latérales de l'archantéron. Alors que les lames latérales se rejoignent ventralement, le mésoderme dorsal s'individualise, la corde s'isole et le mésoderme dorsal se métamérise en somites (blocs métamérisés). La région dorsale externe va donner le dermatome (derme de la peau). La région supérieure interne va donner le myotome (muscle strié), la partie inférieure interne donnera le sclérotome (les vertèbres). L'endoblaste donnera l'épithélium du tube digestif, de l'appareil urinaire et pulmonaire. Celui-ci est en étroite association avec le mésoderme splanchnique.
Au cours de la neurulation, le germe s'allonge dans le sens antéropostérieur. À la fin de cette neurulation, on distingue la tête et la queue : c'est le stade du bourgeon caudal. On assiste à une régionalisation du système nerveux donnant l'encéphale et la moelle épinière. Cet encéphale va devenir inducteur vis-à-vis de l'ectoblaste. Le rhombencéphale induit la placode auditive ou otique.
Xenopus laevis et Xenopus tropicalis : modèles d'étude du développement embryonnaire
Deux espèces de Xenopus sont couramment utilisées dans la recherche sur le développement : X. laevis et X. tropicalis. Chaque espèce offre des avantages spécifiques. Xenopus laevis produit de gros embryons qui sont excellents pour la microchirurgie embryonnaire, l’analyse de la surexpression des gènes, les études biochimiques. De son côté, Xenopus tropicalis est un organisme diploïde qui facilite les études de perte de fonction. Les ovocytes et les embryons de Xenopus tropicalis sont cependant plus petits que ceux de Xenopus laevis. Le génome des xénopes a une conservation importante avec l’Homme. Celui de Xenopus tropicalis contient des orthologues pour environ 79 % des gènes identifiés dans les maladies humaines.
Manipulations génétiques chez Xenopus
L’expression des gènes dans les embryons de xénope peut être facilement manipulée à l’aide de microinjections d’ARNm et d’oligonucléotides morpholino antisens (MO) pour un gain ou une perte de fonction, respectivement. La technique CRISPR/Cas9 peut être utilisée pour créer des mutations gain ou perte-de-fonction ou générer des lignées rapportrices.
Applications de Xenopus dans l'étude du développement
Les embryons de xénope se prêtent très bien à des expériences de microchirurgie embryonnaire. Fait important, parce que les premiers stades de clivage sont holoblastiques, le vitellus (réserves énergétiques) est distribué à toutes les cellules, de sorte que les explants ne nécessitent aucune nutrition supplémentaire car ils peuvent survivre en utilisant les nutriments stockés dans les cellules. Le tissu disséqué se développe et se différencie dans une simple solution saline. Le xénope est aussi utile pour produire des cultures cellulaires de cellules pluripotentes : les cellules de la calotte (ou coiffe) animale, prélevées sur des blastulas.
Exemples d'études utilisant Xenopus
Le xénope a permis des avancées dans des domaines de génétique et de biologie cellulaire plus fondamentaux. La mise en évidence de CSF chez le xénope a permis de comprendre les mécanismes de l'arrêt de la méiose en métaphase II.
Ovules en abondance ?
Alors que les femelles d’insectes, d’amphibiens ou de poissons émettent des gamètes en abondance, celles des mammifères n’ovulent qu’avec parcimonie. Selon les espèces, chaque ponte compte ainsi entre un (femme, vache) et une quinzaine (rongeurs, truie) d’ovules. On peut expliquer cette différence par une meilleure survie de l’embryon chez les mammifères, en particulier parce qu’il est abrité des prédateurs, et par la capacité limitée des femelles de conduire la gestation in utero. On peut également formuler l’hypothèse d’un avantage évolutif de la rareté relative des ovules, laquelle induit celle des embryons issus de chaque couple, une situation propice à la contribution de génomes variés au sein de l’espèce, à chaque génération.
Production d’ovules au laboratoire
Il existe plusieurs stratégies en cours d’expérimentation pour obtenir des ovules fécondables à partir d’ovocytes immatures, de cellules souches embryonnaires, ou même de cellules somatiques.
De l’ovocyte à l’ovule
Rappelons que l’ovule (ou ovocyte II) est issu de l’évolution d’un ovocyte I à l’occasion de la première division méiotique (après émission du premier globule polaire). Cette transformation, ou « maturation ovocytaire », est rapide (environ 30 h dans l’espèce humaine) et survient normalement entre la décharge hypophysaire de l’hormone ovulante LH (ou l’administration de hCG) et la rupture du follicule mûr.
Chez plusieurs espèces de mammifères, des ovocytes ont ainsi été extraits de leurs follicules en croissance avant même l’apparition de l’antrum (ce qui correspond à environ 2,5 mois avant l’ovulation chez la femme) et cultivés jusqu’à l’obtention de leur maturation in vitro (MIV). Les ovules se sont montrés capables de fécondation et de développement normal, mais avec un rendement moindre que des ovules mûris in vivo.
Usages potentiels des ovules
Disposer d’une source abondante d’ovules humains modifierait les pratiques actuelles de l’AMP et pourrait ouvrir la voie à de nouvelles pratiques comme le clonage, grand consommateur de gamètes féminins. L’origine de ces ovules est évidemment à prendre en compte pour leur usage procréatif. Par exemple, même si on obtenait des développements viables à partir d’ovules obtenus par culture in vitro de cellules germinales primordiales embryonnaires, ces ovules ne pourraient pas être utilisés pour la FIV dans le couple ayant produit l’embryon, le partenaire masculin de ce couple étant aussi le père de cet embryon. En revanche, de tels ovules auraient une place potentielle dans la FIV avec don d’ovules et dans les diverses modalités du clonage (« thérapeutique » ou « reproductif »), comme dans la recherche scientifique. Ainsi pourrait-on, par exemple, étudier le rôle de certains gènes dans le développement normal ou pathologique, les mécanismes de la méiose et ceux déterminant l’empreinte génomique. Toutefois, il est évident que ces connaissances sont d’abord à acquérir à partir de modèles animaux.
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