L'insémination artificielle (IA) est une pratique courante dans l'élevage bovin, permettant de diffuser largement le progrès génétique. Cependant, la méiose entraîne une répartition aléatoire des chromosomes X et Y, résultant en un sex-ratio d'environ 51 % de mâles pour 49 % de femelles. Pour les éleveurs laitiers et allaitants, il est souvent plus avantageux de faire naître davantage de femelles, notamment pour l'auto-renouvellement du cheptel et l'amélioration de la sélection intra-troupeau. C'est dans ce contexte qu'intervient la notion de populations de spermatozoïdes pures, obtenues grâce à des techniques de sexage de la semence.
Insémination artificielle et progrès génétique
L’insémination artificielle (IA) s’est développée en France à partir de la fin des années 1940, en particulier chez les bovins. Elle consiste à collecter la semence d’un reproducteur mâle, la conditionner, le plus souvent la congeler, puis la transporter et la mettre en place dans les voies génitales de la femelle. Elle permet le découplage entre production de sperme et insémination, ce qui évite le transport des reproducteurs, limite les risques sanitaires, favorise les échanges à plus grande distance et souvent entre pays. L’avantage majeur de l’IA bovine est la dilution de la semence qui permet de produire jusqu’à plusieurs centaines de doses par éjaculat de taureau. Le nombre de descendants par reproducteur peut ainsi être démultiplié, un taureau pouvant produire plusieurs dizaines de milliers de doses en quelques mois. L’impact considérable de l’insémination dans la diffusion du progrès génétique est rappelé par Boichard (2020). Chez les bovins laitiers, un éleveur pratiquant l’IA peut bénéficier d’un progrès génétique de l’ordre de 0,2 à 0,4 écart-type génétique par an, par la simple utilisation de taureaux d’insémination bien choisis, et sans considérer la sélection intratroupeau qu’il peut pratiquer. Le développement de l’IA dépend surtout de son adéquation pratique au système de production. Elle est très majoritaire chez les bovins laitiers, l’éleveur étant proche de ses vaches pour la détection des chaleurs comme pour l’acte d’insémination.
Le principe du sexage de la semence
La méiose induisant une ségrégation aléatoire des chromosomes X et Y, on attend en espérance 50 % de spermatozoïdes porteurs du X et 50 % de porteurs du Y. En pratique, on observe à la naissance un peu plus de veaux mâles que de femelles (51 % vs 49 %). Ce léger déséquilibre peut être dû à une survie différentielle de l’embryon lors du développement, ou au poids légèrement plus faible des spermatozoïdes mâles, du fait d’un contenu en ADN légèrement plus faible, les favorisant dans la course pour la fertilisation. La production de semence et sa congélation puis l’insémination artificielle ne modifient pas ce sex-ratio des veaux, avec environ 51 % de mâles parmi les veaux nés de semence conventionnelle. En élevage laitier comme allaitant, où très majoritairement le cheptel femelle est en autorenouvellement, faire naître plus de femelles est pourtant d’intérêt majeur, afin d’accroître notamment les possibilités de sélection intratroupeau. Le conditionnement de la semence pour l’insémination implique différentes procédures de préparation et de contrôle et depuis longtemps, des recherches ont été entreprises pour dévier ce sex-ratio dans la direction désirée. Plusieurs procédés ont été proposés et étudiés (Druart & Ribeiro Bento Dos Santos, 2004), basés sur la différence de quantité d’ADN, de volume ou de masse entre spermatozoïdes X et Y, ou sur des différences d’antigènes de surface. Une équipe japonaise a récemment réussi une séparation des spermatozoïdes X et Y après activation des gènes TLR7/8 localisés sur le chromosome X (Umehara et al., 2020). Mais jusqu’à présent, un seul procédé, basé sur du tri cellulaire, est suffisamment abouti pour une application commerciale à grande échelle.
Le principe est de séparer, par un traitement particulier, les spermatozoïdes portant un chromosome X et donnant une femelle, des spermatozoïdes portant un chromosome Y et donnant un mâle. Le procédé appliqué actuellement a été développé par des chercheurs de l’USDA dans les années 1990 (Johnson et al., 1987 ; Johnson & Seidel, 1999) sur différentes espèces de mammifères, puis breveté par la société XY Inc (Johnson, 1992). Le procédé repose sur le tri de spermatozoïdes après traitement de la semence avec une substance, le Hoechst 33342, qui se fixe sur l’ADN. Ce produit est fluorescent quand il est éclairé par les UV et les spermatozoïdes traités, éclairés par un laser UV, sont d’autant plus fluorescents qu’ils contiennent plus d’ADN. Le chromosome X étant plus grand que le chromosome Y, les spermatozoïdes femelles ont plus d’ADN (4 %) que les spermatozoïdes mâles et sont légèrement plus fluorescents, et cette différence est utilisée pour séparer les deux types de spermatozoïdes.
Le processus de tri cellulaire
De façon plus détaillée, la semence est diluée et sa concentration est standardisée, puis elle est traitée au Hoechst 33342 pendant une heure. À l’entrée du trieur de cellules, la solution est finement brumisée de sorte que chaque spermatozoïde est enfermé dans une gouttelette et orienté pour que le signal lumineux soit interprétable, ce qui constitue une des difficultés techniques importantes. En fonction du niveau de fluorescence détecté après éclairage par un laser, les spermatozoïdes sont chargés électriquement positivement ou négativement, et déviés dans l’une ou l’autre direction. Les spermatozoïdes morts, qui n’ont pas intégré de fluorophore Hoechst 33342, sont également éliminés.
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Les distributions de fluorescence mesurée lors du tri n’étant pas disjointes, on ne peut pas retenir les 50 % de spermatozoïdes du sexe choisi. Pour garantir un niveau de pureté suffisant, on ne retient donc que la partie de la distribution constituée en majorité de spermatozoïdes du sexe choisi. L’objectif fréquemment fixé est une précision de tri de 90 à 95 %. Ces valeurs résultent d’un compromis entre pureté souhaitée et quantités produites, car plus la pureté recherchée est élevée, plus importante est la perte de semence et plus long est le procédé, et donc plus la technique est coûteuse. Le rendement est d’autant meilleur que les deux distributions de fluorescence sont moins chevauchantes et il est important que le signal de fluorescence soit le moins bruité possible. En théorie, le procédé permet de produire des doses mâles ou des doses femelles. Mais compte tenu de la dissymétrie de la sélection pratiquée, la fraction non sélectionnée n’est pas utilisable, car elle ne présente pas un niveau de pureté acceptable pour l’autre sexe.
Avancées technologiques et commercialisation
Inventée dans les années 1990, cette technique a largement profité des avancées des technologies de tri cellulaire, avec une augmentation du débit et une diminution du coût, et elle a pu être commercialisée depuis 2004. Une tête de trieur actuel permet d’obtenir environ 6 000 spermatozoïdes triés par seconde, un débit qui permet la production de quelques centaines de doses par machine et par jour. Les doses produites avec le protocole usuel contiennent moins de spermatozoïdes que les doses conventionnelles (environ 2 millions vs 8 millions), ce qui résulte également d’un optimum économique du process. Selon Sexing Technologies, qui reste discret sur la nature des améliorations, le procédé le plus récent, appelé sexedULTRA®, préserve mieux l’intégrité des spermatozoïdes et doit réduire la perte de fertilité. Les semences sexées usuelles garantissent 90 à 92 % de descendants du sexe demandé. L’essentiel des besoins concerne la production de doses femelles pour insémination dans les élevages commerciaux.
Aujourd’hui, trois ateliers de sexage de la semence bovine fonctionnent en France. Propriétés de l’entreprise Sexing Technologies, ils sont installés dans trois centres d’insémination dans l’est (Roulans, 25), l’ouest (St Aubin du Cormier, 35) et plus récemment le nord de la France (Douai, 59). Il arrive que la semence de certains taureaux ne puisse pas être sexée. Ce phénomène est généralement dû à la présence d’un réarrangement chromosomique dans le génome du taureau. La méiose conduit alors à une forte proportion de spermatozoïdes au génome déséquilibré, avec deux copies ou zéro copie du segment chromosomique concerné (Jourdain et al., 2023). Cette variation de quantité d’ADN perturbe la distribution de la fluorescence qui n’est plus représentative de la distribution des chromosomes X et Y. Une impossibilité de sexage est donc un signal d’appel d’un possible réarrangement chromosomique.
Utilisation de la semence sexée en France
L’utilisation de la semence sexée a décollé à partir de 2010, après l’installation du premier laboratoire de sexage en France à Roulans (25). Ce bilan montre des différences très marquées. Tout d’abord, logiquement (comme expliqué en partie 4), la pratique du sexage est très limitée en races allaitantes (quelques %) alors qu’elle est beaucoup plus développée en races laitières. Elle est beaucoup plus importante sur les génisses que sur les vaches, du fait de leur fertilité plus élevée et d’une certaine sécurisation des conditions de naissance. Elle est plus développée sur la première insémination que sur les retours, 76 % des IA sexées étant des IA premières. Elle est très variable entre races : la race jersiaise présente le taux d’utilisation le plus élevé (60 % sur les génisses, 40 % sur les vaches), afin de limiter la naissance de veaux mâles dont la valorisation est quasi nulle ; les races brune et montbéliarde viennent ensuite, avec des niveaux élevés sur les génisses (45 % et 32 %) mais aussi sur les vaches (20 %) ; en races holstein et normande, le niveau d’utilisation est assez élevé en génisses (35 % et 23 %) mais faible en vaches (5 %) ; enfin, les races régionales ont des taux d’utilisation relativement bas. Le surcoût affiché par les entreprises d’insémination varie entre 18 et 25 € par dose.
Les premiers laboratoires ont été installés aux USA, au Royaume-Uni et en Suisse au début des années 2000. Depuis, leur nombre a augmenté et Sexing Technologies propose la même organisation dans chaque pays. Il dispose actuellement de 52 laboratoires de sexage répartis dans 20 pays, installés dans des centres de production de semence pour lesquels ils travaillent en prestation. Chaque laboratoire dispose généralement de plusieurs trieurs voire, pour les plus importants, de plusieurs dizaines de trieurs de cellules. La production mondiale de doses était estimée en 2018 à plus de 10 millions par an (González-Marín et al., 2018).
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Intérêts et limites de la semence sexée
L’intérêt majeur de la technique pour l’éleveur est évident et cette approche renouvelle considérablement la pratique de l’insémination et les stratégies de production de descendants. Elle permet de garantir le sexe du produit avec un haut niveau de fiabilité et donc de produire les génisses de renouvellement à partir de la partie du troupeau choisie par l’éleveur.
Le procédé de sexage correspond à une manipulation lourde et assez longue qui a des conséquences sur la fertilité. Dans un premier temps, la semence est traitée au Hoechst 33342 qui a une certaine cytotoxicité. Même si seuls les spermatozoïdes vivants sont conservés après la phase de tri, il est probable que ce produit altère la survie ultérieure des spermatozoïdes triés. Par ailleurs, le traitement d’un éjaculat dure plusieurs heures, un délai que ne subit pas une semence conventionnelle. Le traitement implique des étapes de dilution, stress de température pendant le marquage, tri sous haute pression, exposition aux rayons laser UV, puis reconcentration. Enfin, pour des raisons économiques et pratiques, le nombre final de spermatozoïdes contenu dans une dose sexée est nettement inférieur à celui d’une dose conventionnelle, même en prenant en compte l’élimination des morts dans le processus de sexage. En 2009, Frijters et al. (2009) attribuaient près des deux tiers de la baisse de fertilité à la concentration plus faible et un tiers au procédé lui-même.
L’analyse de la base nationale permet de mesurer l’impact du sexage sur la fertilité. Le taux de réussite moyen des inséminations artificielles conventionnelles varie d’environ 40 à 65 % selon la race et la parité. De nombreux facteurs affectent le taux de réussite et il convient de bien distinguer l’effet du sexage des autres effets. Le modèle utilisé en évaluation génétique intègre le statut de la semence (conventionnelle ou sexée) parmi de nombreux autres facteurs (troupeau, année, saison, parité, inséminateur, taureau, âge, intervalle mise bas insémination, valeur génétique de la femelle en fertilité…). La prise en compte de ces facteurs permet de limiter les biais liés à des confusions partielles entre effets et d’estimer l’effet propre du sexage de la semence. Dans les trois principales races laitières, la perte de fertilité est systématique et assez importante (-6 à -10 points de réussite à l’IA selon les races, les années, et la parité). Les résultats se sont un peu améliorés dans le temps, surtout chez les vaches holstein et normandes, et la perte n’était plus que de six à huit points ces dernières années. De même, la différence de perte entre génisses et vaches, initialement forte, a pratiquement disparu aujourd’hui. Cette moindre fertilité de la semence sexée est un effet bien connu, comme le montre la méta-analyse de Reese et al. (2021). En conséquence, compte tenu de son surcoût et d’un souhait de maintenir une bonne fertilité du troupeau, la semence sexée est utilisée préférentiellement dans les conditions de fertilité maximale. Elle est donc plutôt pratiquée à la première ou lors des deux premières inséminations, les IA ultérieures correspondant à des vaches nettement moins fertiles. En Holstein, elle est utilisée plutôt chez les génisses que chez les vaches en lactation, alors que cette stratégie est moins nette en Montbéliarde.
Impact sur les produits nés et intégrité du génome
L’impact sur les produits nés est moins connu et en général supposé nul ou négligeable. Il convient cependant de le vérifier, compte tenu de la large diffusion de la semence sexée. Des études ont été réalisées pour répondre à deux questions : i) le procédé de sexage respecte-t-il l’intégrité du génome du produit né ? En effet, le Hoechst 33342 se fixe sur l’ADN et pourrait donc induire des mutations de novo. Le pouvoir mutagène du Hoechst 33342 fait débat. Pour Johnson & Schulman (1994), ce produit n’est pas un intercalant de l’ADN (au sens qu’il ne se fixe pas à l’intérieur de la double hélice) et sa fixation est réversible. De ce fait, il ne serait pas dangereux. Gardiner-Garden (1999), lui, indique qu’il peut déstabiliser les histones de l’ADN et affecter sa compaction dans les spermatozoïdes. Selon Parrilla et al. (2004), il n’a pas d’effet génotoxique sur la semence de verrat. Tirant profit des avancées des technologies de séquençage, des travaux de séquençage du génome ont été conduits en France en 2013-2014 dans le cadre du projet SexSeq financé par APIS-GENE pour répondre à la première question et rechercher les mutations de novo. Une mutation de novo est un variant observé avec certitude chez le produit et absent du génome de ses deux parents. Il existe un taux de mutation naturelle, estimé à environ 10-8 mutation par base d’ADN et par méiose chez les mammifères, soit environ 60-80 néomuta…
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