Introduction
L'étude de l'information génétique chez l'embryon bovin est un domaine en pleine expansion, offrant des perspectives considérables pour l'amélioration de la sélection génomique et la compréhension des anomalies chromosomiques. Les avancées technologiques, notamment dans le domaine du génotypage et de la morphocinétique, ouvrent de nouvelles voies pour analyser et optimiser le développement embryonnaire des bovins. Cet article explore les différentes facettes de cette recherche, en mettant l'accent sur les méthodes de détection des anomalies chromosomiques, les applications potentielles pour la sélection génomique et l'impact des facteurs épigénétiques sur le développement de l'embryon.
Anomalies Chromosomiques et Développement Embryonnaire
Les anomalies chromosomiques, telles que les monosomies (perte d’un chromosome) et les trisomies (présence d’un chromosome supplémentaire), ainsi que d’autres anomalies comme les polyploïdies (présence de plusieurs copies complètes du génome) ou les haploïdies (présence d’un seul jeu de chromosomes au lieu de deux), peuvent gravement compromettre le développement embryonnaire et la viabilité des animaux. La détection précoce de ces anomalies est donc cruciale pour optimiser les taux de réussite en transplantation embryonnaire et améliorer la sélection génomique.
Méthodes de Détection des Anomalies Chromosomiques
Pour détecter ces anomalies, les chercheurs exploitent des données provenant des puces de génotypage, outils largement utilisés pour analyser le patrimoine génétique des bovins. Ces puces permettent de mesurer la quantité d’ADN associée à des fragments chromosomiques spécifiques. L'analyse des informations issues de la fluorescence détectée par les puces à ADN utilisées dans le cadre de la sélection génomique se fait à l’aide de deux indicateurs clés.
Une méthode fiable a été développée pour classer chaque chromosome de chaque embryon comme étant normal, monosomique ou trisomique. Ce travail a nécessité de relever plusieurs défis, notamment l’adaptation de la méthode à la qualité souvent moindre des données de génotypage embryonnaire par rapport à celles des adultes. Après avoir testé différentes approches, une méthode a été sélectionnée, capable de détecter les anomalies même à partir du seuil minimal de qualité attendu pour un génotypage de l’embryon.
Applications Prometteuses pour la Sélection Génomique
L’analyse des données complémentaires issues du génotypage ouvre des perspectives intéressantes pour améliorer la sélection génomique. Un des objectifs est d’intégrer ces informations dans les systèmes actuels, permettant à terme d’appliquer la méthode de détection d’aneuploïdie chez l’embryon, mais aussi de développer des tests pour d’autres anomalies chromosomiques moins délétères mais pouvant avoir un impact sur la carrière et la productivité des animaux.
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Les embryons produits in vitro de race Holstein et issus de la technologie OPU-FIV (Ponction Ovocytaire suivie de Fécondation In Vitro) sont également analysés grâce aux données de fluorescence. De plus, chaque embryon OPU_FIV est suivi en morphocinétique (système Primo-Vision® présent à la station ELIANCE de Nouzilly) afin de suivre en temps réel leur développement.
Épigénétique et Développement Embryonnaire
Outre les facteurs génétiques, les marques épigénétiques jouent un rôle crucial dans le développement embryonnaire. Ces marques, qui modifient l'expression des gènes sans altérer la séquence d'ADN, sont influencées par des facteurs environnementaux et peuvent avoir des conséquences à long terme sur la santé et la productivité des animaux.
Marques Épigénétiques: Définition et Rôle
L'épigénétique se définit comme l'ensemble des marques apposées sur le génome qui induisent des changements de l'expression des gènes sans altération de la séquence d'ADN (Berger et al., 2009). Ces marques sont à la fois stables et héritables au cours des divisions cellulaires. L'épigénome d'une cellule est l'ensemble complet des marques épigénétiques, telles que la méthylation de l'ADN, les modifications post-traductionnelles des histones, le remodelage de la chromatine, les ARN non codants et autres molécules qui peuvent transmettre des informations à travers la mitose en régulant l'expression génique.
L'épigénome est très dynamique tout au long de la vie, et est régi par une interaction complexe de facteurs génétiques et environnementaux (Kouzarides, 2007). En effet, toutes les cellules d'un individu possèdent le même patrimoine génétique qu'elles utilisent de façon variable en exprimant plus ou moins fortement des gènes différents en fonction du stade physiologique et du type cellulaire. Cette information spécifique d'un état cellulaire donné est orchestrée par les marques épigénétiques, activatrices ou inhibitrices, qui ont la capacité de modifier l'expression génique et de définir des phénotypes spécifiques. De plus, les marques épigénétiques apposées sur le génome sont modifiables et/ou réversibles en fonction de l'environnement, et ces modifications peuvent aussi avoir des conséquences à long terme. Le développement d'un individu (embryon, fœtus et nouveau-né ; mais aussi la différenciation et la maturation des cellules germinales) et de façon plus générale la période qui entoure la conception, représente une fenêtre de temps particulièrement sensible aux différents facteurs environnementaux. Le retour à la totipotence nécessaire à l'initiation du programme développemental implique en effet une grande plasticité des marques épigénétiques en terme de diversité, quantité et durée d'action.
Méthylation de l'ADN
Au sein de la séquence d’ADN, les résidus de cytosine des dinucléotides CpG (pour « cytosine-phosphate-guanine ») peuvent être méthylés en 5-méthylcytosine (5meC). Cette méthylation de l’ADN est connue depuis plus de 50 ans, avec la découverte de la 5meC dans l’embryon d’oursin puis la mise en relation de cette marque épigénétique avec l’activité des gènes au cours du développement. Elle est présente chez presque tous les organismes vivants, mais chez les mammifères, seules 5 à 10 % des cytosines du génome sont méthylées. Ce pourcentage semble faible, mais rapporté aux dinucléotides CpG, il dépasse bien souvent 80 %.
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Les sites CpG ne se répartissent pas de manière uniforme le long du génome. Les régions les plus denses en sites CpG sont nommées « îlots CpG » et sont en général méthylées lorsqu’elles sont associées aux éléments répétés du génome, tels que les rétrotransposons (éléments mobiles du génome, d’origine virale accumulés au cours de l’évolution) et les séquences satellites centromériques et péricentromériques. La méthylation de l’ADN au niveau des rétrotransposons, est nécessaire pour prévenir leur réplication et protéger le génome contre leur invasion. La méthylation des séquences satellites péricentromériques intervient quant à elle dans la formation de l’hétérochromatine constitutive, essentielle pour limiter les recombinaisons et ségrégations chromosomiques indésirables.
Associée à des éléments régulateurs ou à des promoteurs, la méthylation de l’ADN inhibe l’expression des gènes, tandis qu’au niveau intragénique elle aurait un rôle activateur en limitant les démarrages de transcription illégitimes (Schubeler, 2015). La méthylation de l’ADN intervient également dans l’inactivation du chromosome X, qui permet de compenser le double dosage allélique chez les femelles, ainsi que dans les processus d’empreinte parentale décrits pour une centaine de gènes chez l’Homme et la souris. Les gènes soumis à empreinte s’expriment de manière mono-allélique en fonction de l’origine parentale de l’allèle ; cette expression mono-allélique est indispensable au bon déroulement du développement et à une croissance harmonieuse du fœtus. Ces gènes ne semblent pas complètement conservés entre espèces, et leur liste chez le bovin n’est à ce jour pas exhaustive.
Les fonctions de la méthylation de l’ADN sont médiées par des protéines nucléaires portant un domaine de liaison à l’ADN méthylé et capables de recruter des répresseurs transcriptionnels ou des enzymes de modification des marques d’histones. Les DNMT (ADN méthyltransférases) sont les enzymes qui catalysent le transfert des groupes méthyle sur la position 5 des cytosines à partir du métabolite S-adénosylméthionine (produit à partir d’acide folique apporté par l’alimentation). Les enzymes DNMT3A et DNMT3B sont impliquées dans la méthylation de novo qui se met en place lors des processus de différenciation cellulaire, mais également en réponse à un stimulus dans les cellules différenciées. L’enzyme DNMT1, qui reconnaît les sites CpG hémiméthylés issus de la réplication de l’ADN, assure le maintien et la propagation des patrons de méthylation à travers la division cellulaire (Lyko, 2018).
La déméthylation peut ainsi résulter d’une absence d’activité de DNMT1, la méthylation de l’ADN étant progressivement diluée au cours des cycles cellulaires. Des mécanismes de déméthylation active de l’ADN sont également observés lors des vagues de reprogrammation épigénétique ayant lieu dans les précurseurs des cellules germinales et l’embryon préimplantatoire.
Modifications des Histones
Dans le noyau, l’ADN génomique est enroulé autour d’octamères de quatre types d’histones (H2A, H2B, H3 et H4) pour former le nucléosome. Les histones sont de petites protéines basiques, ce qui facilite leur liaison à l’ADN, contenant également des queues N-terminales ciblées par différents types de modifications : acétylation, méthylation, phosphorylation, ubiquitylation, sumoylation, ribosylation, désamination et isomérisation. Ces modifications touchent différents acides aminés, produisant ainsi des dizaines de variants post-traductionnels avec des rôles fonctionnels différents. L’addition ou le retrait de ces modifications sont des processus très flexibles qui affectent directement l’accessibilité de l’ADN génomique par la machinerie de transcription, et donc l’activation ou la répression de l’expression génique (Kouzarides, 2007).
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La combinatoire des différentes marques d’histones (« code des histones »), en association avec la méthylation de l’ADN et la présence de certains facteurs de transcription ou de l’ARN polymérase, définissent des états chromatiniens associés à différents états transcriptionnels. Ces états chromatiniens sont transmis aux cellules filles, assurant la continuité de l’identité cellulaire à travers la mitose.
Les modifications d'histones reposent sur l'utilisation de métabolites issus de l'alimentation (acétyl-coA et S-adénosylméthionine) et sont contrôlées par une importante machinerie épigénétique, comprenant des enzymes capables d'apposer, d'effacer et de lire ces marques. Les acétylations et désacétylations ont été décrites dès les années 1960 (Allfrey et Mirsky, 1964). Fruits de l'activité des histones acétyltransférases (HAT), les acétylations ont pour effet de neutraliser la charge positive de l'histone, d'augmenter son encombrement stérique et de diminuer la force de son interaction avec l'ADN. Les lysines acétylées permettent également le recrutement de protéines à bromodomaine qui interviennent dans le remodelage de la chromatine. Il résulte de ces différents modes d'action une ouverture de la chromatine (euchromatine) et une augmentation locale de l'activité transcriptionnelle (Mujtaba et al., 2007). Les processus de désacétylation, qui ont une action opposée sur la transcription, font intervenir les histones désacétyltransférases (HDAC) et sont associés à la formation de l'hétérochromatine (chromatine compacte).
Les méthylations, qui consistent en l'addition d'un ou plusieurs groupe(s) méthyle(s) sur les résidus lysines ou arginines des queues d'histones, sont catalysées par des histones méthyltransférases (KMT) tandis que les déméthylations résultent de l'activité des histones déméthylases (KDM) (Jenuwein, 2006). À la position H3K4, la triméthylation (H3K4me3) est une signature d'activité transcriptionnelle, en particulier lorsqu'elle est combinée avec une acétylation. À l'inverse, la méthylation est associée à une répression transcriptionnelle lorsqu'elle touche H3K27 et H4K20 et à l'hétérochromatine constitutive à la position H3K9, en association avec la protéine HP1 et la méthylation de l'ADN (Nishibuchi et Dejardin, 2017).
Enfin, il est important de noter qu’un type de cellule échappe à la structure en nucléosome : le spermatozoïde, où selon les espèces 85 à 99 % des histones sont remplacées par des protamines, protéines riches en arginine formant des structures en forme de tores avec l’ADN (Carrell, 2012).
ARN Non-Codants
La découverte des ARN non-codants a bouleversé le dogme selon lequel chaque gène codait une protéine possédant une fonction cellulaire. Des recherches récentes ont mis en évidence de nombreuses formes d'ARN non-codants soulignant leurs rôles dans la physiologie et leurs implications dans de nombreuses pathologies (Bayoumi et al., 2016).
Les ARN non-codants sont divisés en sous-classes selon leur taille, leur fonction ou leur localisation génomique. Les petits ARN non-codants comprennent les ARN dont la taille est inférieure à 200 nucléotides, parmi lesquels les microARN (miARN, 19-24 nucléotides). Chez les mammifères, plus de 2 000 miARN par espèce sont actuellement répertoriés dans la base publique de référence miRBase. Au niveau génomique, les miARN peuvent être organisés en cluster (Griffiths-Jones et al., 2008) ; ils partagent alors un promoteur commun et sont transcrits en large polycistrons (grand fragment d'ARN contenant plusieurs miARN). Les gènes de miARN peuvent également être localisés dans les introns de gènes codants ou non. Ces gènes de miARN introniques peuvent soit partager le même promoteur que leur hôte, soit utiliser un promoteur distinct ou même plusieurs sites d'initiation de la transcription (Monteys et al., 2010).
La biosynthèse de miARN fonctionnels et l’assemblage du complexe RISC (« RNA-induced silencing complex ») font appel à une cascade de réactions enzymatiques se regroupant en cinq étapes : i) transcription du gène codant le miARN sous forme de miARN primaire (pri-miARN), ii) maturation du pri-miARN en précurseur (pré-miARN) au niveau nucléaire, iii) export du pré-miARN du noyau vers le cytoplasme, iv) maturation du pré-miARN en miARN mature et v) formation du complexe RISC. Ce complexe est guidé par le miARN vers ses transcrits cibles par homologie partielle de séquences entre les deux espèces d’ARN il peut induire ensuite l’inhibition de la traduction ou la dégradation des ARN messagers. Un miARN peut ainsi cibler une centaine d’ARNm différents et un ARNm peut être ciblé par plusieurs dizaines de miARN différents.
En participant à la régulation de l’expression génique, les miARN ont des rôles clés dans l’ensemble des fonctions biologiques chez les mammifères (Bushati et Cohen, 2007). Les fonctions des miARN dans la prolifération, la différenciation ou la mort cellulaire sont conservées au cours de l’évolution et entrent en jeu dans toutes les voies biologiques citons par exemple la réponse immune, le rythme circadien ou encore le développement cérébral.
Les études de profils d'expression des miARN indiquent que la majorité d'entre eux est sous le contrôle de signaux développementaux et/ou tissus-spécifiques, comme miR-1 qui représente 45 % des miARN exprimés dans le cœur et miR-122 qui représente 72 % des miARN du foie (Lagos-Quintana et al., 2002). Le contrôle précis du niveau d'expression des miARN est crucial pour maintenir les fonctions physiologiques de la cellule, et les dérégulations de leur expression sont souvent associées à des pathologies telles que le cancer (Landgraf et al., 2007).
Interaction Embryon-Mère et Développement Précoce
Chez les mammifères, le développement de l'embryon commence dans l'oviducte, un organe tubulaire reliant l'ovaire à l'utérus. L'embryon bovin s’y développe pendant les 4 à 5 jours qui suivent la fécondation, jusqu'au stade de 8-16 cellules (morula) Il est alors en contact étroit avec les cellules épithéliales et leur sécrétion : le fluide tubaire. L’hypothèse est que les protéines contenues dans le fluide tubaire favorisent le développement précoce de l’embryon.
Plus de 400 embryons aux stades 4-6 cellules et jeune morula produits in vitro, ont été incubés ou non (témoins) dans des fluides tubaires recueillis chez des vaches juste après l’ovulation. Toutes les protéines présentes ont été identifiées et quantifiés par spectrométrie de masse à haute résolution dans les deux groupes d'embryons et dans le fluide tubaire utilisé. Une analyse comparative des données de spectrométrie a permis d'identifier 56 protéines présentes dans le fluide tubaire et surabondantes dans les embryons pré-incubés : ces protéines ont été définies comme protéines d’interaction. L'oviductine (OVGP1) et plusieurs annexines (ANXA1, ANXA2, ANXA4), sont parmi les plus abondantes. Trois des protéines identifiées (OVGP1, ANXA1 et PYGL) ont été localisées par immunomarquage à la fois dans l'espace périvitellin et dans les cellules des embryons pré-incubés dans le fluide tubaire, montrant qu’elles sont capables de traverser la zone pellucide (matrice extra-cellulaire qui entoure l’ovocyte et l’embryon qu’il contient) et d'être internalisées par l'embryon.
Une analyse bio-informatique a montré que les protéines interagissant avec l'embryon sont véhiculées par des nanovésicules extracellulaires (ou oviductosomes) et impliquées dans un large éventail de fonctions, essentiellement métaboliques et cellulaires. Ces données fournissent de nouvelles connaissances sur les protéines impliquées dans le développement préimplantatoire et l'établissement de la gestation chez les bovins.
Après la fécondation, chez les mammifères, le génome de l’embryon nouvellement formé est d’abord inactif : aucune protéine n’est produite. Le développement de l’embryon ne dépend donc que de l’héritage maternel en ARN et en protéines présents dans l’ovocyte et accumulés au cours de la période de croissance et de maturation avant l’ovulation.
Amélioration de la Sélection Génétique et Transplantation Embryonnaire
L’arrivée de la génomique a profondément changé les méthodes de travail, avec une sélection de plus en pointue sur la voie mâle. La transplantation intra-troupeau, donneuse et receveuses appartenant au même troupeau, va permettre à l’éleveur de démultiplier une femelle de haut niveau génétique. Il n’est plus nécessaire d’attendre plusieurs gestations pour obtenir plusieurs veaux d’une femelle, le progrès génétique est donc accéléré. Les génisses obtenues pourront ainsi remplacer les vaches de plus faible niveau génétique.
Il est possible d’acheter des embryons. Cela va à la fois amener de la diversité dans votre troupeau et augmenter son niveau génétique. Cette action vise à dynamiser l’activité de transplantation embryonnaire pour développer la voie femelle chez tous les éleveurs dans les trois races où COOPEL est engagée dans un schéma de sélection : Charolaise, Montbéliarde et Prim’Holstein et pérenniser ainsi le rôle moteur de la coopérative en terme de création génétique.
Sexage des Embryons
La méthode de sexage en laboratoire mobile, mise en service par Gènes Diffusion, permet de limiter la manipulation des embryons. La technique de sexage des embryons par PCR (amplification en chaîne par polymérase) est utilisée en France depuis 1990. C'est grâce à cette technique, qui consiste à dupliquer in vitro une faible quantité d'ADN prélevée sur l'embryon, qu'il est possible de déterminer son profil génétique.
Le protocole repose d'abord sur la réalisation d'une biopsie, c'est-à-dire le prélèvement de cinq à dix cellules de l'embryon par micromanipulation à l'aide d'un microscope, afin d'extraire des fragments d'ADN. La quantité prélevée étant insuffisante pour déterminer le sexe de l'embryon, ces fragments sont mis en étuve dans un mix réactionnel afin d'en obtenir plusieurs millions de copies identiques sous l'action d'enzymes (amplification). Les techniciens en transplantation embryonnaire de Gènes Diffusion s'appuient désormais sur un protocole de sexage des embryons par PCR en temps réel, appelé qPCR. À partir d'un logiciel conçu par les chercheurs de la plate-forme génomique de l'union de coopératives, cette méthode offre l'avantage de pouvoir visualiser en temps réel la lecture des fragments d'ADN. Ainsi, la suppression d'une manipulation, qui correspond à la migration entre l'étape d'amplification de l'ADN et la lecture des résultats, permet de réduire le temps d'analyse à 1 h 30, soit 45 min de moins par analyse qu'une PCR classique.
Pendant l'analyse, l'embryon "patiente" en laboratoire dans un milieu de culture. En réduisant la durée de l'analyse, il passera moins de temps hors de l'utérus maternel. Cette accélération du processus entre la biopsie et la transplantation effective de l'embryon sur la receveuse vise à améliorer le taux de réussite en gestation. Cette technique de sexage largement utilisée au Canada est réalisable à la ferme à partir d'un laboratoire mobile.
Optimisation du Taux de Gestation
Optimiser le taux de gestation est un argument économique à faire valoir pour promouvoir la transplantation embryonnaire. En effet, compte tenu du prix de l'embryon (de 300 à 1 200 €), ce mode de reproduction reste confidentiel si on le compare à l'insémination. En 2012, Gènes Diffusion a réalisé sur l'ensemble du territoire national environ 1 600 collectes pour une production de 10 275 embryons, soit une moyenne annoncée de 6,28 embryons viables par collecte. Statistiquement en France, la moyenne est de 5,5 embryons viables et le taux de gestation obtenu en ferme après transplantation est variable en fonction des pratiques : le taux de gestation moyen après transplantation d'embryons frais sexés par PCR est de 60 % et de 52 % avec des embryons sexés et congelés. Il est de 65 % avec des embryons frais non sexés.
Selon les animaux et la technicité des éleveurs, le taux de gestation peut s'élever dans certains cas à 80 %. Dans la pratique, l'embryon peut patienter entre 5 et 6 heures à 20°C hors de l'utérus sans être affecté. Dès lors, réduire le nombre de manipulations est une avancée par rapport à la procédure classique, mais il faudra attendre les résultats du qPCR obtenus sur le terrain pour confirmer d'éventuels gains sur le taux de réussite.
En ferme, le raccourcissement du temps d'analyse renforce l'efficacité des techniciens ; ce qui rend plus facile l'organisation du chantier de sexage et le transfert d'embryons frais, en particulier chez les femelles ayant présenté une forte réponse à la superovulation. Si le nombre de receveuses s'avère limité par rapport au nombre d'embryons viables prélevés, la congélation est un recours. À l'inverse, lorsque la quantité d'embryons est inférieure au nombre de receveuses disponibles, l'embryon peut être coupé en deux lors d'une opération de chirurgie réalisée dans le laboratoire mobile avant d'être implanté sur deux receveuses.
Depuis les années 80, la transplantation embryonnaire permet aux éleveurs de valoriser leurs femelles par la vente d’embryons ou la production de mâles destinés aux CIA français, voire européens. L’embryon est également un moyen d’introduire un meilleur potentiel génétique ou une autre race. En cas d’apparition d’un problème sanitaire grave sur le troupeau, l’embryon est, sous réserve de quelques contraintes sanitaires définies par le législateur, le moyen efficace de stocker temporairement de la génétique.
Suite à une récolte, les embryons peuvent être sexés puis sont soit transférés sur les receveuses, ou congelés. Malgré le suivi des animaux, des pathologies, des anomalies et des spécificités sont parfois révélées à différents moments d’une opération de production d’embryons. L’efficacité de la transplantation sur le terrain fait qu’elle n’a pas été détrônée par la fécondation in vitro ou le clonage. L’amélioration de son efficacité et de sa rentabilité est plutôt liée à l’utilisation de semence sexée, voire à terme à la recherche des marqueurs génétiques directement sur une biopsie. En fonction de l’objectif choisi par l’éleveur, le praticien doit adapter son conseil sanitaire lors de la préparation de la transplantation.
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