Introduction
La cryoconservation des embryons bovins est devenue une étape essentielle pour la préservation du matériel génétique en vue de sa valorisation future. Cependant, les embryons produits in vitro présentent une qualité inférieure à celle des embryons produits in vivo, ce qui entraîne des taux de gestation moins élevés. La biopsie d'embryons, combinée à des techniques d'amplification d'ADN, offre la possibilité de réaliser des diagnostics génétiques précoces, notamment pour le sexage et la sélection génomique. Cet article explore les protocoles de biopsie d'embryons bovins, les techniques associées et les efforts visant à améliorer la qualité et la cryosurvie des embryons biopsiés.
Défis et enjeux de la cryoconservation des embryons bovins
Lors de la congélation, les membranes cellulaires des embryons, principalement composées de lipides, sont soumises à des contraintes physiques et chimiques qui peuvent provoquer la lyse des cellules embryonnaires. Il est donc crucial d'améliorer la qualité des embryons bovins produits in vitro et biopsiés afin d'optimiser les taux de gestation après cryoconservation et transfert.
Amélioration de la qualité des embryons par la modulation du profil lipidique
Des recherches ont été menées pour mieux comprendre le profil lipidique des embryons produits in vitro et pour moduler ce profil par l'ajout d'acides gras oméga-3. L'objectif est d'augmenter la fluidité membranaire et de réduire la cryosensibilité des embryons. Les résultats ont montré que le profil lipidique des embryons est fortement influencé par le processus de production in vitro et les protocoles de cryoconservation. Bien que la modulation du profil lipidique par l'ajout d'oméga-3 n'ait pas d'impact significatif sur le développement et la cryosurvie des embryons, elle semble améliorer leur qualité globale.
Intérêt du CRYO3 dans la cryoconservation des embryons biopsiés
L'étude de l'intérêt du CRYO3 dans la formulation de milieux de cryoconservation synthétiques pour les embryons bovins produits in vitro et biopsiés a permis d'approfondir les connaissances sur les protocoles de cryoconservation.
Technique de sexage des embryons par PCR
La technique de sexage des embryons par PCR (amplification en chaîne par polymérase) est utilisée en France depuis 1990. Elle consiste à dupliquer in vitro une faible quantité d'ADN prélevée sur l'embryon pour déterminer son profil génétique. Le protocole comprend une biopsie, c'est-à-dire le prélèvement de cinq à dix cellules de l'embryon par micromanipulation à l'aide d'un microscope, afin d'extraire des fragments d'ADN. Ces fragments sont ensuite amplifiés en étuve dans un mix réactionnel pour obtenir plusieurs millions de copies identiques sous l'action d'enzymes.
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PCR en temps réel (qPCR)
Les techniciens en transplantation embryonnaire utilisent désormais un protocole de sexage des embryons par PCR en temps réel, appelé qPCR. Cette méthode, basée sur un logiciel conçu par des chercheurs, permet de visualiser en temps réel la lecture des fragments d'ADN. La suppression d'une étape de manipulation réduit le temps d'analyse à 1 h 30, soit 45 minutes de moins qu'une PCR classique.
Avantages de la qPCR
La qPCR permet de réduire la durée pendant laquelle l'embryon "patiente" en laboratoire dans un milieu de culture, ce qui vise à améliorer le taux de réussite en gestation. Cette technique de sexage est réalisable à la ferme à partir d'un laboratoire mobile, ce qui limite la manipulation des embryons.
Impact économique du sexage et de la transplantation embryonnaire
L'optimisation du taux de gestation est un argument économique important pour promouvoir la transplantation embryonnaire. Compte tenu du prix élevé d'un embryon, ce mode de reproduction reste confidentiel par rapport à l'insémination. En France, le taux de gestation moyen après transplantation d'embryons frais sexés par PCR est de 60 %, et de 52 % avec des embryons sexés et congelés. Il est de 65 % avec des embryons frais non sexés.
Facteurs influençant le taux de gestation
Le taux de gestation peut varier en fonction des animaux et de la technicité des éleveurs, atteignant parfois 80 %. L'embryon peut patienter entre 5 et 6 heures à 20°C hors de l'utérus sans être affecté. La réduction du nombre de manipulations est donc une avancée par rapport à la procédure classique.
Alternatives à la transplantation directe
Si le nombre de receveuses est limité par rapport au nombre d'embryons viables prélevés, la congélation est une solution. À l'inverse, lorsque la quantité d'embryons est inférieure au nombre de receveuses disponibles, l'embryon peut être coupé en deux lors d'une opération de chirurgie réalisée dans le laboratoire mobile avant d'être implanté sur deux receveuses.
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Sélection génomique et génotypage préimplantatoire
La sélection génomique, associée au développement de technologies de la reproduction, permet de réaliser le génotypage préimplantatoire et l'indexation des embryons pour les principales races bovines. La France se positionne parmi les pays leaders en génomique pour la sélection des bovins des grandes races laitières.
Stratégies d'évaluation génétique des embryons
Des stratégies d'évaluation génétique des embryons collectés 7 jours après insémination sont combinées à la biopsie de cellules embryonnaires, à la superovulation, au transfert d'embryon (TE) et à la ponction d'ovocytes (ovum pick up - fécondation in vitro [OPU-FIV]). Les différentes étapes conduisant à l'estimation du potentiel génétique de l'embryon et les principaux aspects pratiques assurant un génotypage réussi ont été mis au point.
Avantages du génotypage préimplantatoire
Ces outils facilitent la gestion des receveuses dans les troupeaux et le diagnostic précoce des anomalies génétiques. Le premier veau génotypé et indexé au stade embryonnaire est né en 2011, avec une parfaite concordance entre ses index estimés avant son implantation et ceux calculés après sa naissance.
Prélèvement de cellules embryonnaires sans altérer la viabilité
La disponibilité limitée des femelles receveuses reste une contrainte majeure. La technique de biopsie d'embryons combinée à la PCR permet un diagnostic du sexe avant transfert. Le compromis réside dans la viabilité de l'embryon, tout en obtenant une quantité d'ADN suffisante pour l'analyse. Les embryons biopsiés sont cultivés in vitro pendant 24 à 48 heures ou immédiatement transférés frais ou congelés chez des receveuses synchronisées. Les taux de gestation varient de 47,3 à 62,3 % après transfert direct d'embryons biopsiés congelés, selon le stade de développement embryonnaire ou la méthode de biopsie. Lorsque les embryons sont transférés à l'état frais, les taux de gestation ont tendance à être corrélés à leur qualité et au stade embryonnaire.
Défis techniques de la congélation des embryons produits in vitro et biopsiés
La congélation des embryons produits in vitro et biopsiés reste un défi technique. Les taux de survie après décongélation des blastocystes congelés lentement à - 25 °C dans le glycérol seul sont plus bas que ceux des blastocystes congelés à - 25 °C ou à - 30 °C dans ce milieu additionné de sucrose. Les effets positifs du sucrose sont également observés chez les embryons collectés in vivo puis biopsiés.
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Stratégies pour assurer une production d'ADN génomique suffisante
Le génotypage de l'embryon a été rapporté comme avantageux dès l'utilisation de la sélection assistée par marqueurs (SAM). Un des défis majeurs de la sélection génomique au stade embryonnaire est la détection de SNP à partir d'un petit échantillon d'ADN prélevé chez un embryon préimplantatoire.
Amplification du pangénome (WGA)
L'amplification du pangénome (méthode whole genome amplification [WGA]) est possible grâce à de nouvelles techniques de biologie moléculaire. Cette méthode a été développée pour la préamplification de petites quantités d'ADN génomique afin d'utiliser une cellule unique. La méthode WGA est utilisée dans une variété d'applications incluant le génotypage à haut débit. Des kits commerciaux d'amplification selon la méthode WGA sont disponibles avec de bonnes fiabilité et exactitude.
Application de la méthode WGA
Dans des conditions de terrain, l'ADN issu de biopsies d'embryon bovins est amplifié avec le mini-kit ultrarapide WGA-REPLI-g, selon un protocole mis au point. Après amplification, le processus génère une quantité d'ADN génomique de 5 à 7 µg, c'est-à-dire 40 000 fois supérieure, au minimum, à la quantité initiale.
Du génotypage à l'index génomique de l'embryon
La faisabilité de l'indexation génomique des embryons a été vérifiée en comparant les taux de marqueurs détectés à partir de cellules embryonnaires et d'un prélèvement de sang chez le veau issu du transfert. Le génotypage a été réalisé à l'aide de la puce bovine Illumina SNP50®.
Évaluation de l'efficacité du génotypage
Des phénomènes de "perte d'allèles" peuvent conduire à des erreurs d'interprétation du génotype. Il a donc été nécessaire d'adapter la méthode de calcul utilisée pour l'indexation et de fixer un seuil en deçà duquel le génotypage n'est pas possible. Une valeur seuil de CR de 85 % a été validée comme une étape préalable à l'indexation des embryons.
Indexation génomique des embryons
En raison des phénomènes de perte d'allèles, la méthode d'indexation fait intervenir un modèle d'imputation dans lequel seuls les marqueurs "fiables" sont pris en compte pour l'estimation des index génomiques. Une très bonne corrélation entre les index calculés chez le veau et l'embryon a été observée.
Mise en œuvre pratique
L'indexation génomique des embryons est désormais opérationnelle pour les trois grandes races laitières. Sa mise en œuvre nécessite une équipe de transfert embryonnaire formée à la micromanipulation des embryons et à la préparation de l'ADN avant génotypage. L'indexation des embryons suit la même chaîne informatique et le même calendrier que les autres animaux, ce qui permet d'envisager une utilisation à plus large échelle.
Amélioration des techniques de manipulation des embryons
Des formations sont proposées pour améliorer les techniques de manipulation des embryons, dans le cadre de biopsies ou de bissections. Les objectifs sont de connaître les bases de la méthodologie pour réaliser des biopsies ou des bissections par coupe sur les embryons bovins, et de réaliser au quotidien des biopsies/bissections sur des embryons produits in vitro ou collectés in vivo, sans altérer leur capacité de développement.
Programme de formation
Le programme de formation comprend des bases théoriques sur la biopsie/bissection d'embryons, la fabrication de pipettes de maintien et des couteaux, ainsi que des manipulations pratiques sur des embryons bovins produits in vitro ou collectés in vivo.
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