Introduction
Le Xenopus laevis, communément appelé xénope lisse, est un amphibien anoure originaire d'Afrique australe et appartenant à la famille des Pipidae. Cet organisme aquatique est largement utilisé dans la recherche biologique, notamment pour l'étude du développement embryonnaire. Cet article se penche sur les caractéristiques des ovules non fécondés de xénope, leur obtention, leur utilisation et leur importance dans divers domaines de la recherche.
Caractéristiques Générales du Xenopus Laevis
Le Xenopus laevis est un amphibien dont le mode de vie est essentiellement aquatique. Il ne remonte à la surface que pour respirer. Les mâles sont toujours plus petits que les femelles. Ils possèdent des pattes postérieures très musclées et garnies d'une large palmure, ce qui en fait d'excellents nageurs. La coloration de la peau est variable et modulée par l'éclairement de l'environnement et du substrat.
Leur mode de vie aquatique facilite leur élevage en laboratoire, car ils se contentent d'un simple aquarium ou d'un bac rempli d'eau. L'eau d'élevage doit être dépourvue de chlore et la température maintenue à 22 °C. Il est préférable de consacrer à l'élevage une pièce thermostatée à 24 °C et éclairée par des tubes fluorescents.
Obtention des Ovules Non Fécondés
Stimulation Hormonale
L'ovulation peut être obtenue artificiellement avec des hormones gonadotropes du commerce. Pour garantir le succès de l'opération, il est préférable de préparer plusieurs femelles et de les stimuler tous les trois mois dans des conditions d'élevage et d'alimentation optimales.
L’ovulation est induite par l’injection d’hormone gonadotrope chorionique (Chorionic Gonadotropin, Sigma, 10.000 I.U. per vial, code CG-10) dans les sacs lymphatiques dorsaux. Le xénope possède un espace entre la peau et le plan musculaire sous-jacent, divisé en compartiments remplis de liquide lymphatique et en communication avec le système circulatoire lymphatique. Cette disposition anatomique favorise l'injection et la diffusion des hormones. Pour éviter le reflux, il est conseillé de piquer l'aiguille dans le haut de la cuisse à travers un septum et de serrer le lieu d'injection pendant quelques secondes.
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Les femelles en stimulation sont ensuite remises séparément dans un aquarium situé à l'écart et recouvert d'un couvercle, dans une pièce isolée du passage afin d'éviter toute forme de stress qui risquerait de compromettre le succès de la ponte. Dans ces conditions, les animaux commencent à pondre une douzaine d'heures après la piqûre, à la température ambiante de 22 °C.
Gestion des Femelles
Les femelles ayant pondu sont stockées dans un aquarium, à part des femelles prêtes à pondre. Il est recommandé de les marquer et d'enregistrer sur un répertoire d'élevage la date de ponte, la quantité d'œufs produits, les pourcentages de fécondation et de développement. Ces données assurent la traçabilité des animaux. Une femelle ayant fourni des pontes en quantité et en qualité peut ainsi être suivie et remise à pondre tous les trois mois.
Fécondation In Vitro
La fécondation in vitro nécessite une biopsie du mâle. Bien qu'aisément réalisable sur un amphibien, une biopsie est un acte chirurgical qui requiert légalement une habilitation, accordée pour des laboratoires de recherche.
Pour la fécondation in vitro, il est possible d'effectuer un broyat à partir de biopsies testiculaires dans un milieu de culture pour amphibien (MBS: Modified Barth’s Saline). Quelques gouttes de ce milieu de culture sont déposées sur les œufs. Une autre méthode consiste à appliquer sur la surface des oeufs, des fragments de biopsie testiculaire. La section du testicule libère des spermatozoïdes fécondants. Cette dernière méthode permet de conserver les fragments testiculaires plusieurs jours au réfrigérateur dans le milieu de culture. Les spermatozoïdes restant dans les tubes séminifères se conservent plus longtemps que dans la première méthode.
Environ 10 minutes après l'application des spermatozoïdes, la coupelle est remplie de MBS 0.1X. L'avantage de cette technique réside dans le fait que l'on peut obtenir des lots d'œufs fécondés au même moment et qui se développent de manière synchrone.
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Utilisations des Ovules Non Fécondés
Recherche sur les Canaux Ioniques
Les œufs non fécondés peuvent être utilisés pour les expérimentations d'expression de canaux ioniques, canaux assurant le transport des ions dans les cellules, afin de mieux comprendre leur mécanisme de fonctionnement et l'impact de molécules pharmaceutiques sur leur régulation. Le modèle xénope est très intéressant car les ovocytes sont capables d’exprimer de nombreuses protéines qu’il est ensuite aisé de caractériser grâce, entre autre, à des méthodes d’électrophysiologie.
Étude du Développement Embryonnaire
Les embryons de xénope sont largement utilisés pour étudier le développement embryonnaire. Ils sont nombreux, robustes et leur développement externe permet des analyses non invasives dès la fécondation et à tous les stades. Le xénope est un modèle où on peut très facilement voir les mouvements de la gastrulation.
Génétique et Biologie Cellulaire
Le xénope a permis des avancées dans des domaines de génétique et de biologie cellulaire plus fondamentaux. Par exemple, la mise en évidence du CSF (Cytostatic Factor) chez le xénope a permis de comprendre les mécanismes de l'arrêt de cycle en métaphase II de l'ovocyte.
Tests de Grossesse
Historiquement, Xenopus laevis était utilisé comme test de grossesse (test de Hogben). De l’urine en provenance de la femme dont on veut savoir si elle enceinte est injecté dans une femelle Xénope. Si au bout de 48 heures, une ponte s’est déclenchée, cela veut dire que l’urine de la femme contenait de l’hCG (ou hormone chorionique gonadotropique) produite par le placenta et qui a provoqué la ponte des xénopes.
Avantages du Modèle Xénope
Facilité d'Élevage et de Maintenance
Le xénope est facile à élever et à maintenir en laboratoire, et des pontes peuvent être obtenues à la demande.
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Développement Externe et Rapide
Le développement de l'embryon précoce est facilement suivi. Leur développement est rapide et sa progression peut être modulée par la température. En 3 jours l'embryon de xénope sort de ses gangues au moment de l'éclosion. Ensuite, il faut compter en semaines pour la période larvaire (environ 5 à 6), puis en mois de la métamorphose à l'état adulte (6 à 12).
Manipulation Génétique Facile
L’expression des gènes dans les embryons de xénope peut être facilement manipulée à l’aide de microinjections d’ARNm et d’oligonucléotides morpholino antisens (MO) pour un gain ou une perte de fonction, respectivement.
La technique CRISPR/Cas9 peut être utilisée pour créer des mutations gain ou perte-de-fonction ou générer des lignées rapportrices.
Analyse Comparative des Structures
L'injection d'une seule cellule de l'embryon à deux cellules peut cibler le côté gauche ou droit de l'embryon. En utilisant des traceurs fluorescents (GFP) ou enzymatiques (β-galactosidase), on peut facilement détecter le côté injecté de l'embryon et le comparer au côté non injecté.
Microchirurgie Embryonnaire
Les embryons de xénope se prêtent très bien à des expériences de microchirurgie embryonnaire. Le tissu disséqué se développe et se différencie dans une simple solution saline. Le xénope est aussi utile pour produire des cultures cellulaires de cellules pluripotentes : les cellules de la calotte (ou coiffe) animale, prélevées sur des blastulas.
Considérations Éthiques et Règle des 3R
L'utilisation des xénopes dans la recherche est soumise à des considérations éthiques strictes, notamment l'application de la règle des "3R":
- Remplacement: Les applications des recherches réalisées sur les xénopes nécessitent des observations sur un tissu ou individu entier, et la production d’œufs nécessite des géniteurs vivants.
- Réduction: Pour réduire le cheptel nécessaire, il est possible de mutualiser les utilisations, de stimuler les femelles plusieurs fois et de faire correspondre les pontes demandées par les utilisateurs au renouvellement des stocks d’individus dans l’animalerie.
- Raffinement: Les animaux sont hébergés et élevés dans une animalerie agréée et les procédures sont optimisées. Tout est mis en œuvre pour enrichir le milieu et améliorer le bien-être animal.
Exemples d'Études Utilisant le Xénope
Analyse du Transcriptome d'Explants de Calotte Animale
Le xénope est un excellent modèle pour l'analyse du transcriptome d'explants de calotte animale. Des ARNm de gènes d’intérêt sont injectés dans toutes les cellules d’un embryon au stade 4 cellules. La calotte animale est ensuite prélevée au stade 9 et cultivée jusqu’à l’équivalent du stade 12. Les cellules de la calotte animale sont cultivées non dissociées (les cellules donnent alors de l’épiderme) ou dissociées (elles donnent du tissu neural). Les ARNm des cellules ont été purifiés puis soumis au RNAseq.
Étude de l'Évolution de l'Arrêt en Prophase de l'Ovocyte
L'équipe s'est penchée sur un des substrats connus de PKA, appelé ARPP19, chez le Xénope, un amphibien très étudié dans les laboratoires. Ciblée par PKA, ARPP19 est essentielle pour l’arrêt en prophase de l’ovocyte. Ils ont découvert que ARPP19 de Clytia n’est pas une cible de PKA parce que son motif de reconnaissance par PKA est légèrement différent de celui du Xénope.
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