La culture in vitro de végétaux, ou micropropagation, s'est largement répandue depuis la fin des années 1960. Cette technique repose sur la capacité des cellules végétales à régénérer une nouvelle plante dans des conditions adéquates. Elle offre de nombreuses applications dans l'amélioration des plantes, notamment chez le tournesol.
Micropropagation et amélioration des plantes
La qualité des semences et des jeunes plants est essentielle pour améliorer la compétitivité des entreprises du secteur végétal. Cela passe par l'utilisation de variétés améliorées ou de plants produits selon un cahier des charges particulier. La micropropagation permet de multiplier à grande échelle et rapidement des végétaux sélectionnés pour leur qualité. Elle est majoritairement utilisée pour les végétaux à multiplication végétative, tels que les plantes ornementales, fruitières ou forestières.
Sauvetage d'embryons immatures : un outil pour les croisements difficiles
Pour accroître la variabilité génétique et introduire des gènes de résistance aux maladies, les sélectionneurs réalisent souvent des croisements interspécifiques. Cependant, le croisement de plantes éloignées génétiquement peut être délicat. Le sauvetage d'embryons immatures in vitro permet d'obtenir une descendance viable dans ces cas. Cette technique est également utilisée après des croisements intraspécifiques lorsqu'il existe des obstacles physiologiques à la survie de la graine.
En cas d'impossibilité d'obtenir une descendance pour le croisement désiré, la technique de fusion de protoplastes peut être utilisée pour combiner des organites cellulaires précis.
Haplodiploïdisation : fixation rapide du matériel génétique
L'étape finale de fixation du matériel génétique est souvent très longue, pouvant nécessiter six à huit générations. En produisant une plante diploïde à partir d'une cellule haploïde (gynogenèse ou androgénèse), puis en doublant le nombre de chromosomes, on obtient une plante parfaitement homozygote en une seule génération, le plus souvent grâce à une étape in vitro.
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L'haploïdie se produit spontanément, mais rarement, chez certaines espèces. On peut obtenir des plantes haploïdes par différentes méthodes, notamment :
- La culture d'anthères
- La culture de microspores isolées
- La culture d'ovaires ou d'ovules
- La culture de pollen
- À partir de croisements interspécifiques
L'haplodiploïdisation est une méthode utilisée pour fixer plus rapidement le matériel génétique en cours de sélection. Elle repose sur l'obtention de plantes haploïdes à partir des organes mâles ou femelles, puis sur le doublement du stock chromosomique. Ainsi, le sélectionneur dispose de plantes diploïdes homozygotes où l'ensemble du génome est fixé. C'est donc une technique rapide de production de lignées pures en une seule étape, au lieu de sept à huit générations. Avec cette méthode, la durée d'un cycle de sélection est raccourcie de trois à quatre ans.
Cette technique présente l'avantage de faciliter la sélection. Le sélectionneur peut faire un choix plus large, car l'haplodiploïdisation fixe les différentes recombinaisons possibles entre les caractéristiques des lignées parentales. Il peut également faire un choix plus sûr, car il possède un matériel homogène. Il y a donc séparation des deux phases de la création variétale : la fixation des caractères d'une part et la sélection des meilleures plantes d'autre part. De plus, cette méthode permet d'observer l'expression aussi bien des gènes récessifs que des gènes dominants, ce qui est particulièrement intéressant en sélection.
Cette technique est largement utilisée chez l'asperge, le blé, le colza, l'orge, l'aubergine et le piment.
Processus d'haplodiploïdisation
Le processus d'haplodiploïdisation comprend l'obtention de plantes haploïdes à partir des cellules produisant les gamètes mâles ou femelles, et le retour vers la phase diploïde.
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- Production de plantes mères : Le sélectionneur effectue un croisement entre deux lignées parentales présentant des caractéristiques intéressantes et complémentaires. Ce croisement produit la génération F1, qui constitue les plantes mères pour l'obtention de la phase haploïde. À ce stade, toutes les plantes sont identiques. Cependant, sur ces plantes, la méiose à l'origine de la formation des gamètes permet les recombinaisons et la ségrégation des caractères, selon les lois de Mendel et les recombinaisons entre les chromosomes parentaux. Les individus F2 seront alors tous différents les uns des autres, c'est la disjonction des caractères. Pour faciliter le travail de sélection, l'haplodiploïdisation va permettre d'obtenir des plantes homozygotes.
- Obtention de la phase haploïde : Il s'agit de récupérer les cellules ayant subi la méiose avant la fécondation. C'est là que commence le travail de laboratoire. L'obtention des plantes haploïdes peut se faire par culture in vitro de cellules destinées à fournir les cellules reproductrices ou gamètes. S'il s'agit de gamètes mâles, on parle d'androgenèse. S'il s'agit de gamètes femelles, c'est la gynogenèse. Une autre méthode d'obtention d'haploïdes est l'induction d'haploïdes in situ. On peut obtenir des haploïdes après croisements entre espèces ou entre genres. Il y a fécondation, mais les chromosomes incompatibles du parent pollinisateur sont rejetés naturellement. Il est possible également de provoquer une fécondation anormale à l'aide de pollen dénaturé. Dans ces trois cas, on observe le développement d'un embryon haploïde. Une phase de sauvetage d'embryons in vitro est ensuite généralement nécessaire. Mis en culture sur des milieux particuliers, l'embryon haploïde se développe, les tissus se différencient pour donner des plantes haploïdes.
- Retour à l'état fertile diploïde : Pour utiliser en sélection une plante régénérée par l'une de ces voies, il faut disposer de plantes fertiles et donc diploïdes. L'état haploïde étant instable, l'individu régénéré est parfois diploïde, par doublement spontané du stock chromosomique. Pour le blé, 20 à 25 % d'haploïdes sont doublés spontanément, 60 à 65 % chez l'orge. Sinon, il est possible de provoquer artificiellement un doublement des chromosomes, le plus couramment par l'action d'un agent chimique, la colchicine. Les plantes obtenues sont des diploïdes homozygotes : elles possèdent deux copies identiques de chacun de leurs chromosomes et portent donc des paires de gènes ou allèles identiques, d'où leur grand intérêt.
- Sélection des lignées au champ : Le sélectionneur trie les plantes en fonction des critères agronomiques et technologiques recherchés.
Traitement à la colchicine
La colchicine bloque la mitose en début de métaphase, empêchant la séparation des chromosomes fils. La cellule conserve donc son génome doublé (n plus n = 2n). Ainsi, les cellules deviennent diploïdes. Le traitement à la colchicine peut se réaliser au stade plantule par trempage des racines ou injection dans les méristèmes. Les taux de doublement sont alors très variables (plante chimérique). Pour l'éviter, se développent actuellement des traitements in vitro au stade embryonnaire afin d'obtenir des individus dont toutes les cellules sont haploïdes doublés.
Déterminisme du niveau de ploïdie
Une vérification de la ploïdie des plantes régénérées peut être effectuée précocement par cytométrie de flux. Une substance fluorescente se liant à l'ADN permet la coloration des noyaux des cellules. La mesure de la densité de cette coloration permet de déterminer le niveau de ploïdie.
Androgenèse
L'androgenèse a été la première voie d'obtention d'haploïdes in vitro. Les plantes haploïdes ont été obtenues par culture d'anthères (sacs contenant le pollen). Plus récemment, la culture de microspores (grains de pollen immatures) a été mise au point.
Culture d'anthères
L'androgenèse est la voie d'haplodiploïdisation privilégiée chez le blé, car il est relativement facile de mettre en culture un très grand nombre d'anthères. Ainsi, cette technique a été mise en place dans les programmes de sélection du blé tendre. Les épis sont récoltés au stade montaison d'où les anthères sont extraites en conditions stériles. Elles sont mises en culture en boîte de pétri sur des milieux spécifiques, induisant le développement embryonnaire des microspores. Des examens cytologiques préalables sont nécessaires pour connaître le moment de prélèvement le plus favorable à ce développement. Les boîtes de pétri sont ensuite placées dans des chambres de culture où l'éclairement, la température et l'humidité sont contrôlés pour favoriser l'androgenèse. Quelques semaines après la mise en culture des anthères, les embryons haploïdes apparaissent. Ils sont prélevés sous loupe binoculaire et repiqués sur des milieux nutritifs permettant une différenciation des tissus et l'induction du développement de la plante. Les plantules bien développées sont à nouveau repiquées en tube. Cette voie androgénétique est utilisée chez le blé, le riz, la pomme de terre, le tabac, le maïs, l'asperge et le piment et est très efficace sur colza, l'orge et l'aubergine.
Culture de microspores
Elle est utilisée en routine sur les crucifères comme le colza. Elle reste actuellement difficile sur les céréales (avoine, blé, riz…) et les légumineuses. Chez le colza, les boutons floraux sont sélectionnés sur les inflorescences. Les grains de pollen immatures sont isolés mécaniquement par broyage des boutons, et filtration de la suspension. On induit directement la formation d'embryons par la culture des microspores en milieu liquide agité. À partir d'embryons de trois semaines, il est ensuite possible de régénérer des plantes. La variété de colza d'hiver Goéland, inscrite en 1990, est issue de cette technique.
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Application particulière à la production d'hybrides chez l'asperge
L'androgenèse a été particulièrement exploitée chez l'asperge, car elle est le seul moyen efficace pour produire des variétés hybrides mâles. L'asperge est une espèce dioïque : elle possède des pieds mâles et des pieds femelles. Les plantes mâles sont recherchées en sélection, car elles sont précoces et plus productives. Les pieds mâles sont Mm pour les chromosomes sexuels et les femelles sont mm. La voie de l'androgenèse permet d'obtenir soit des individus MM appelés super-mâles, soit des individus mm donc femelles. Les croisements de ces super-mâles avec des femelles donnent des individus mâles, ce qui permet en les sélectionnant de pouvoir créer des variétés hybrides mâles. Ainsi, cela permet d'exploiter l'hétérosis, important chez cette espèce.
Haploïdie induite par croisement interspécifique
Le croisement interspécifique entre une espèce cultivée et une espèce sauvage permet parfois de produire des plantes haploïdes. En effet, après fécondation au cours des premières divisions cellulaires, les chromosomes de l'espèce sauvage sont éliminés. On obtient ainsi un embryon haploïde ne comportant que les chromosomes de l'espèce cultivée. Cette méthode s'applique à l'orge, à la pomme de terre, ainsi qu'à quelques génotypes de blé. Le croisement interspécifique de l'orge cultivée et de l'orge sauvage bulbeuse permet l'obtention d'embryons haploïdes d'orge cultivée. La culture in vitro est alors nécessaire pour permettre à ce type d'embryon de poursuivre son développement et de donner une plante. Une application particulière est utilisée pour la sélection de la pomme de terre. La pomme de terre cultivée est tétraploïde (4n = 48). La réduction du stock chromosomique est obtenue par pollinisation de la pomme de terre cultivée par une espèce sauvage Solanum phureja. Ce système permet d'obtenir des plantes diploïdes. Ces plantes peuvent être alors facilement croisées par des espèces sauvages, fréquemment diploïdes, ce qui permet de restaurer la tétraploïdie. Cette méthode est utilisée pour apporter de nouveaux caractères chez la pomme de terre cultivée.
Haploïdie induite par croisement inter-générique
Plus récemment, les croisements entre genres ont été étudiés. La pollinisation du blé dur par du pollen de maïs offre la possibilité de produire des plantes haploïdes chez le blé dur, espèce récalcitrante aux techniques de culture d'anthères.
Haploïdie induite par l'utilisation de pollen dénaturé
L'induction d'haploïdes est également possible par pollinisation avec du pollen dénaturé par irradiation. Cette technique s'est révélée utile pour tout un ensemble d'espèces légumières et est utilisée couramment chez le melon. L'étape de culture in vitro des embryons haploïdes est là aussi obligatoire.
Haploïdie induite par gynogenèse
Elle consiste à mettre en culture in vitro des ovules ou des ovaires prélevés sur la plante avant fécondation. Des plantes haploïdes ont pu être obtenues chez l'orge, le tabac, le blé, le riz, le maïs, la betterave… Sur la betterave, la gynogenèse est la technique la plus opérationnelle de production d'haploïdes, même si on obtient moins de 8% d'haploïdes. Elle permet notamment de travailler sur des betteraves mâles fertiles, aussi bien que sur des betteraves mâles stériles (contrairement à la culture d'anthères). Les fleurs sont disséquées sous la loupe binoculaire en conditions aseptiques. Les ovules sont déposés sur une boîte de pétri contenant un milieu inducteur et sont placés en chambre de culture.
Applications concrètes au tournesol : résistance au stress hydrique et fixation de lignées pures
Ce travail fait état de deux applications concrètes de la culture d'embryons immatures à l'amélioration du tournesol, l'objectif sous-jacent étant d'évaluer la variabilité génétique du matériel sur lequel ont été appliquées ces techniques.
- L'une permet de créer des contraintes hydriques durant la culture ''in vitro'' au stade juvénile (embryon ou plantule), afin de sélectionner le matériel plus résistant au déficit hydrique.
- L'autre se réfère à la culture ''in vitro'' des embryons immatures dans la fixation de lignées pures par la méthode de filiation monograine (SSD), afin d'accélérer la sélection.
Pour la première approche, un hybride interspécifique entre H. annuus et H. anomalus a été fabriqué, dans le but d'obtenir du matériel possédant une base génétique élargie. Ceci pour faciliter la sélection ''in vitro'' des génotypes plus résistants au déficit hydrique. Il a été constaté qu'au fur et à mesure que la concentration du mannitol augmente, le développement des embryons et des plantules diminue. Le potentiel hydrique foliaire aussi tend à diminuer avec l'augmentation de la concentration en mannitol. Les plantes adultes provenant de descendances sélectionnées par mannitol au stade ''jeunes plantules'', sont plus proches du phénotype H. anomalus que celles qui proviennent des descendances témoins ou sélectionnées sur mannitol au stade ''embryons''. Le test sécheresse sur descendances F5 montre que le matériel qui a subi une sélection sur mannitol ''in vitro'', présente des réponses différentes par rapport au témoin vis-à-vis du stress. La méthode de sélection précoce sur ''mannitol in vitro'' pourrait permettre, de façon relativement simple de sélectionner des plantes présentant certaines caractéristiques foliaires plus adaptées à supporter les conditions de sécheresse au champ.
La deuxième approche a permis d'obtenir des semences F5 en 375 jours à partir du croisement diallèle initial de 7 parents. Les effets de la culture ''in vitro'' se traduisent par une série de modifications morphovégétatives et physiologiques sur les plantes qui ont été limitées par réduction de la durée du séjour ''in vitro''. L'évaluation de la variabilité génétique des lignées pures (F6) issues de la culture d'embryons immatures a été réalisée dans un délai de 890 jours. Les résultats montrent un élargissement de la variabilité au niveau des lignées issues du croisement diallèle par rapport aux parents. En outre, le dispositif a permis de tester la présence d'épistasie (homozygote x homozygote) chez les lignées F6. L'analyse factorielle discriminante de l'aptitude à la combinaison, qui reflète une divergence génétique, a permis de détecter le rapport de parenté entre les géniteurs. D'autre part, entre les descendances F3 et F5, des corrélations phénotypiques significatives ont été mises en évidence pour 6 des caractères étudiés. Par contre, une assez forte variation de ces deux types de corrélations a été constatée sur 3 familles entre les lignées F6 et la valeur hybride en F4.
Autres applications de la culture in vitro
La culture de méristèmes a permis, dans les années 1950, de guérir des plantes virosées, en particulier chez les plantes qui sont multipliées végétativement : pomme de terre, fraisier, tulipe, etc. Les méristèmes sont formés de cellules non différenciées qui sont présentes dans les bourgeons à l'extrémité des tiges et des racines et qui peuvent, en se multipliant, donner naissance à tous les tissus de la plante. L'intérêt des méristèmes réside dans le fait que ce sont des structures indemnes de virus.
La culture in vitro d'embryons permet de réaliser plusieurs générations par an en évitant la phase de maturation de la graine. En effet, les embryons sont prélevés quelques jours après la fécondation et non à maturité de la graine. Cette technique est très utilisée chez le tournesol et dans une moindre mesure chez le maïs.
On obtient des protoplastes à partir de cellules végétales dont la paroi a été dégradée par des enzymes. Ces cellules peuvent non seulement fusionner entre elles mais encore régénérer des plantes entières. C'est ce qu'ont utilisé les chercheurs pour transférer le caractère de stérilité mâle cytoplasmique naturel du radis dans le colza. L'intérêt est d'obtenir des plantes de colza mâle stériles qui permettent la production d'hybrides à l'échelle commerciale chez cette plante qui normalement s'autoféconde.
La création de lignées pures est une étape nécessaire dans les programmes d'amélioration des plantes. Elle permet de stabiliser les combinaisons génétiques favorables obtenues par sélection. Dans une lignée pure, les plantes sont "homozygotes" pour tous les caractères, c'est-à-dire que les deux lots de chromosomes homologues sont identiques. On commence par obtenir une plante haploïde par exemple en cultivant des grains de pollen isolés (une plante haploïde ne possède qu'un seul lot de chromosomes).
La commercialisation d'une variété nécessite de pouvoir la reproduire à l'identique et en grande quantité. À partir d'un fragment de la plante, mis en culture dans des milieux complexes appropriés, on régénère des plantes entières identiques à la plante de départ.
La technique de culture d'embryons immatures permet de réduire fortement la dormance des graines fraîchement récoltées, et ainsi d'assurer un développement homogène des embryons. Cette technique permet donc un gain de temps, par réduction de la durée entre deux générations. On peut cultiver plusieurs générations par an et accélérer les procédures classiques de sélection : la fixation et la conversion de lignées, car plusieurs cycles d'autofécondations ou de rétrocroisements successifs peuvent être réalisés chaque année.
Application au tournesol
La technique de culture d'embryons immatures est très pratiquée chez le tournesol où les phénomènes de dormance des graines sont particulièrement intenses. Elle est très facile à mettre en œuvre, et permet d'obtenir 4 à 5 générations successives par an, au lieu d'une seule en culture normale, car le cycle végétatif est ramené à 80 jours. Elle est utilisée pour réaliser la fixation de lignées, la reconversion de lignées mâles fertiles en mâles stériles, ou l'introduction de gènes de résistance. Les jeunes graines sont prélevées 8 à 15 jours après la fécondation, selon le génotype. Elles sont désinfectées et disséquées. Les embryons ainsi isolés sont mis en culture en boîte de pétri. Au bout de 3 à 5 jours, on observe la formation de cotylédons chlorophylliens. Ils sont alors transférés en milieu d'enracinement, jusqu'à l'apparition d'un système racinaire assez développé. Les plantules ainsi obtenues sont alors mises en acclimatation puis repiquées dans du terreau.
Une technique simplifiée de sauvetage d'embryons de tournesol a également été mise au point, où toutes les étapes de l'extraction des graines du capitule jusqu'au repiquage sur terreau sont réalisées en conditions non stériles.
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