Introduction
Les marques épigénétiques, de par leur rôle majeur en santé humaine, font l’objet d’une attention croissante dans la littérature scientifique mais aussi dans les médias. L'épigénétique, définie comme l'ensemble des marques apposées sur le génome qui induisent des changements de l'expression des gènes sans altération de la séquence d'ADN, joue un rôle crucial dans le développement embryonnaire et la différenciation cellulaire. Ces marques sont à la fois stables et héritables au cours des divisions cellulaires. Cet article explore l'épigénétique, en particulier dans le contexte des animaux d'élevage, en mettant en lumière les mécanismes épigénétiques clés et leur influence sur le développement.
L'Épigénétique : Définition et Importance
Initialement utilisé pour décrire l'influence de l'environnement sur le développement des phénotypes, le terme « épigénétique » a beaucoup évolué depuis son introduction en 1942 par Conrad H. Waddington. L'épigénome d'une cellule est l'ensemble complet des marques épigénétiques, telles que la méthylation de l'ADN, les modifications post-traductionnelles des histones, le remodelage de la chromatine, les ARN non codants et autres molécules qui peuvent transmettre des informations à travers la mitose en régulant l'expression génique. L'épigénome est très dynamique tout au long de la vie, et est régi par une interaction complexe de facteurs génétiques et environnementaux. En effet, toutes les cellules d'un individu possèdent le même patrimoine génétique qu'elles utilisent de façon variable en exprimant plus ou moins fortement des gènes différents en fonction du stade physiologique et du type cellulaire. Cette information spécifique d'un état cellulaire donné est orchestrée par les marques épigénétiques, activatrices ou inhibitrices, qui ont la capacité de modifier l'expression génique et de définir des phénotypes spécifiques. De plus, les marques épigénétiques apposées sur le génome sont modifiables et/ou réversibles en fonction de l'environnement, et ces modifications peuvent aussi avoir des conséquences à long terme. Le développement d'un individu (embryon, fœtus et nouveau-né ; mais aussi la différenciation et la maturation des cellules germinales) et de façon plus générale la période qui entoure la conception, représente une fenêtre de temps particulièrement sensible aux différents facteurs environnementaux. Le retour à la totipotence nécessaire à l'initiation du programme développemental implique en effet une grande plasticité des marques épigénétiques en terme de diversité, quantité et durée d'action.
Mécanismes Épigénétiques Clés
Méthylation de l'ADN
Au sein de la séquence d’ADN, les résidus de cytosine des dinucléotides CpG (pour « cytosine-phosphate-guanine ») peuvent être méthylés en 5-méthylcytosine (5meC). Cette méthylation de l’ADN est connue depuis plus de 50 ans, avec la découverte de la 5meC dans l’embryon d’oursin puis la mise en relation de cette marque épigénétique avec l’activité des gènes au cours du développement. Elle est présente chez presque tous les organismes vivants, mais chez les mammifères, seules 5 à 10 % des cytosines du génome sont méthylées. Ce pourcentage semble faible, mais rapporté aux dinucléotides CpG, il dépasse bien souvent 80 %.
Les sites CpG ne se répartissent pas de manière uniforme le long du génome. Les régions les plus denses en sites CpG sont nommées « îlots CpG » et sont en général méthylées lorsqu’elles sont associées aux éléments répétés du génome, tels que les rétrotransposons (éléments mobiles du génome, d’origine virale accumulés au cours de l’évolution) et les séquences satellites centromériques et péricentromériques. La méthylation de l’ADN au niveau des rétrotransposons, est nécessaire pour prévenir leur réplication et protéger le génome contre leur invasion. La méthylation des séquences satellites péricentromériques intervient quant à elle dans la formation de l’hétérochromatine constitutive, essentielle pour limiter les recombinaisons et ségrégations chromosomiques indésirables. Au niveau des régions flanquant les îlots CpG, la méthylation de l’ADN est particulièrement dynamique en fonction du type cellulaire, du stade de développement, de la physiologie de l’animal ou de l’environnement.
Associée à des éléments régulateurs ou à des promoteurs, la méthylation de l’ADN inhibe l’expression des gènes, tandis qu’au niveau intragénique elle aurait un rôle activateur en limitant les démarrages de transcription illégitimes (Schubeler, 2015). La méthylation de l’ADN intervient également dans l’inactivation du chromosome X, qui permet de compenser le double dosage allélique chez les femelles, ainsi que dans les processus d’empreinte parentale décrits pour une centaine de gènes chez l’Homme et la souris. Les gènes soumis à empreinte s’expriment de manière mono-allélique en fonction de l’origine parentale de l’allèle ; cette expression mono-allélique est indispensable au bon déroulement du développement et à une croissance harmonieuse du fœtus. Ces gènes ne semblent pas complètement conservés entre espèces, et leur liste chez le bovin n’est à ce jour pas exhaustive.
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Les fonctions de la méthylation de l’ADN sont médiées par des protéines nucléaires portant un domaine de liaison à l’ADN méthylé et capables de recruter des répresseurs transcriptionnels ou des enzymes de modification des marques d’histones. Les DNMT (ADN méthyltransférases) sont les enzymes qui catalysent le transfert des groupes méthyle sur la position 5 des cytosines à partir du métabolite S-adénosylméthionine (produit à partir d’acide folique apporté par l’alimentation). Les enzymes DNMT3A et DNMT3B sont impliquées dans la méthylation de novo qui se met en place lors des processus de différenciation cellulaire, mais également en réponse à un stimulus dans les cellules différenciées. L’enzyme DNMT1, qui reconnaît les sites CpG hémiméthylés issus de la réplication de l’ADN, assure le maintien et la propagation des patrons de méthylation à travers la division cellulaire (Lyko, 2018). La déméthylation peut ainsi résulter d’une absence d’activité de DNMT1, la méthylation de l’ADN étant progressivement diluée au cours des cycles cellulaires. Des mécanismes de déméthylation active de l’ADN sont également observés lors des vagues de reprogrammation épigénétique ayant lieu dans les précurseurs des cellules germinales et l’embryon préimplantatoire.
Modifications des Histones
Dans le noyau, l’ADN génomique est enroulé autour d’octamères de quatre types d’histones (H2A, H2B, H3 et H4) pour former le nucléosome. Les histones sont de petites protéines basiques, ce qui facilite leur liaison à l’ADN, contenant également des queues N-terminales ciblées par différents types de modifications : acétylation, méthylation, phosphorylation, ubiquitylation, sumoylation, ribosylation, désamination et isomérisation. Ces modifications touchent différents acides aminés, produisant ainsi des dizaines de variants post-traductionnels avec des rôles fonctionnels différents. L’addition ou le retrait de ces modifications sont des processus très flexibles qui affectent directement l’accessibilité de l’ADN génomique par la machinerie de transcription, et donc l’activation ou la répression de l’expression génique (Kouzarides, 2007). La combinatoire des différentes marques d’histones (« code des histones »), en association avec la méthylation de l’ADN et la présence de certains facteurs de transcription ou de l’ARN polymérase, définissent des états chromatiniens associés à différents états transcriptionnels. Ces états chromatiniens sont transmis aux cellules filles, assurant la continuité de l’identité cellulaire à travers la mitose.
Les modifications d'histones reposent sur l'utilisation de métabolites issus de l'alimentation (acétyl-coA et S-adénosylméthionine) et sont contrôlées par une importante machinerie épigénétique, comprenant des enzymes capables d'apposer, d'effacer et de lire ces marques. Les acétylations et désacétylations ont été décrites dès les années 1960 (Allfrey et Mirsky, 1964). Fruits de l'activité des histones acétyltransférases (HAT), les acétylations ont pour effet de neutraliser la charge positive de l'histone, d'augmenter son encombrement stérique et de diminuer la force de son interaction avec l'ADN. Les lysines acétylées permettent également le recrutement de protéines à bromodomaine qui interviennent dans le remodelage de la chromatine. Il résulte de ces différents modes d'action une ouverture de la chromatine (euchromatine) et une augmentation locale de l'activité transcriptionnelle (Mujtaba et al., 2007). Les processus de désacétylation, qui ont une action opposée sur la transcription, font intervenir les histones désacétyltransférases (HDAC) et sont associés à la formation de l'hétérochromatine (chromatine compacte). Les méthylations, qui consistent en l'addition d'un ou plusieurs groupe(s) méthyle(s) sur les résidus lysines ou arginines des queues d'histones, sont catalysées par des histones méthyltransférases (KMT) tandis que les déméthylations résultent de l'activité des histones déméthylases (KDM) (Jenuwein, 2006). À la position H3K4, la triméthylation (H3K4me3) est une signature d'activité transcriptionnelle, en particulier lorsqu'elle est combinée avec une acétylation. À l'inverse, la méthylation est associée à une répression transcriptionnelle lorsqu'elle touche H3K27 et H4K20 et à l'hétérochromatine constitutive à la position H3K9, en association avec la protéine HP1 et la méthylation de l'ADN (Nishibuchi et Dejardin, 2017).
Enfin, il est important de noter qu’un type de cellule échappe à la structure en nucléosome : le spermatozoïde, où selon les espèces 85 à 99 % des histones sont remplacées par des protamines, protéines riches en arginine formant des structures en forme de tores avec l’ADN (Carrell, 2012).
ARN Non-Codants
La découverte des ARN non-codants a bouleversé le dogme selon lequel chaque gène codait une protéine possédant une fonction cellulaire. Des recherches récentes ont mis en évidence de nombreuses formes d'ARN non-codants soulignant leurs rôles dans la physiologie et leurs implications dans de nombreuses pathologies (Bayoumi et al., 2016). Les ARN non-codants sont divisés en sous-classes selon leur taille, leur fonction ou leur localisation génomique. Les petits ARN non-codants comprennent les ARN dont la taille est inférieure à 200 nucléotides, parmi lesquels les microARN (miARN, 19-24 nucléotides). Chez les mammifères, plus de 2 000 miARN par espèce sont actuellement répertoriés dans la base publique de référence miRBase. Au niveau génomique, les miARN peuvent être organisés en cluster (Griffiths-Jones et al., 2008) ; ils partagent alors un promoteur commun et sont transcrits en large polycistrons (grand fragment d'ARN contenant plusieurs miARN). Les gènes de miARN peuvent également être localisés dans les introns de gènes codants ou non. Ces gènes de miARN introniques peuvent soit partager le même promoteur que leur hôte, soit utiliser un promoteur distinct ou même plusieurs sites d'initiation de la transcription (Monteys et al., 2010).
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La biosynthèse de miARN fonctionnels et l’assemblage du complexe RISC (« RNA-induced silencing complex ») font appel à une cascade de réactions enzymatiques se regroupant en cinq étapes : i) transcription du gène codant le miARN sous forme de miARN primaire (pri-miARN), ii) maturation du pri-miARN en précurseur (pré-miARN) au niveau nucléaire, iii) export du pré-miARN du noyau vers le cytoplasme, iv) maturation du pré-miARN en miARN mature et v) formation du complexe RISC. Ce complexe est guidé par le miARN vers ses transcrits cibles par homologie partielle de séquences entre les deux espèces d’ARN il peut induire ensuite l’inhibition de la traduction ou la dégradation des ARN messagers. Un miARN peut ainsi cibler une centaine d’ARNm différents et un ARNm peut être ciblé par plusieurs dizaines de miARN différents. En participant à la régulation de l’expression génique, les miARN ont des rôles clés dans l’ensemble des fonctions biologiques chez les mammifères (Bushati et Cohen, 2007). Les fonctions des miARN dans la prolifération, la différenciation ou la mort cellulaire sont conservées au cours de l’évolution et entrent en jeu dans toutes les voies biologiques citons par exemple la réponse immune, le rythme circadien ou encore le développement cérébral.
Les études de profils d'expression des miARN indiquent que la majorité d'entre eux est sous le contrôle de signaux développementaux et/ou tissus-spécifiques, comme miR-1 qui représente 45 % des miARN exprimés dans le cœur et miR-122 qui représente 72 % des miARN du foie (Lagos-Quintana et al., 2002). Le contrôle précis du niveau d'expression des miARN est crucial pour maintenir les fonctions physiologiques de la cellule, et les dérégulations de leur expression sont souvent associées à des pathologies telles que le cancer (Landgraf et al., 2007). Leur dérégulation peut jouer un rôle…
Épigénétique et Production Animale
Pour les productions animales et en particulier chez les bovins, l'objectif est d'accroître la productivité tout en respectant la santé et le bien-être des animaux. D'importants efforts de sélection génétique ont été réalisés au cours des cinq dernières décennies, et de nombreux marqueurs génétiques ont été associés à la production laitière, la qualité de la viande, la reproduction et les caractères de croissance (Bouquet et Juga, 2013 ; Boichard et al., 2016). Cependant, la génétique ne permet d'expliquer qu'une partie de la variabilité phénotypique des caractères d'intérêt pour l'éleveur ; les modifications épigénétiques contribuent également à cette variabilité.
Production In Vitro d'Embryons (PIV)
La production in vitro d'embryons (PIV), d’une importance croissante pour la reproduction animale, est largement utilisée en élevage bovin. Cependant, le développement d'embryons fécondés in vitro reste inefficace, puisqu’un tiers seulement des embryons bovins in vitro donnent des blastocystes. L'une des causes supposées de l'arrêt embryonnaire précoce est l'échec de l'activation du génome embryonnaire (EGA). Cette période critique pour le développement est caractérisée par un remodelage global de la chromatine et une activation progressive de la transcription, elle a lieu entre le stade 4- et 8 cellule chez le bovin, mais reste mal connue. Ainsi, l’ambition de REPRO2BOS est de mieux comprendre cette période essentielle et de développer des stratégies pour en améliorer l’efficacité.
Le facteur de transcription (TF) DUX, exprimé juste avant l'EGA, joue un rôle important dans le développement chez la souris et semble même critique pour l’embryon humain. DUX est un facteur pionnier, capable de se lier à la chromatine compactée et de recruter une histone acétyltransférase (HAT), ce qui entraîne hyperacétylation de l'histone H3 sur la lysine 27 (H3K27ac), reprogrammation de la chromatine et activation de gènes cibles clés de l’EGA. Ces évènements de remodelage de la chromatine sont complexes, avec des vagues successives d’acétylation/déacétylation, qui permettent une régulation fine de la progression de l’EGA. Les enzymes modifiant la chromatine utilisent comme substrats ou cofacteurs des métabolites spécifiques, dont la disponibilité est critique dans la régulation de l’EGA. Par ailleurs, la surexpression de DUX dans les cellules souches embryonnaires (CSE) humaines et murines induit une reprogrammation vers un état de type totipotent. Ces cellules, au transcriptome proche d’embryons au stade EGA, ont un potentiel de développement plus important que les CSE conventionnelles.
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REPRO2BOS est basé sur les prémices suivants obtenus chez le bovin: (1) des motifs de liaison à DUX sont présents dans des régions du génome active avant l’EGA ; (2) l’orthologue bovin DUXC est exprimé dès avant l’EGA ; (3) la neutralisation de DUXC à l’aide de siRNAs induit un arrêt de développement. Les objectifs de REPRO2BOS sont de déchiffrer le rôle et la régulation de DUXC dans le développement de l'embryon bovin, mettre en place un modèle cellulaire de reprogrammation des CSE bovines vers un état similaire au 8C, élucider les liens entre disponibilité de métabolites spécifiques et remodelage de la chromatine. Une meilleure compréhension du rôle de DUXC dans les embryons et les CSE bovines pourrait non seulement améliorer l'efficacité de la PIV, mais aussi élargir les applications potentielles des cellules souches.
REPRO2BOS sera organisé en 4 tâches : La tâche 1 vise à compléter nos expériences préliminaires sur l'expression de DUXC au cours du développement embryonnaire et l'effet de sa déplétion sur l'expression des gènes (RNAseq) et le remodelage de la chromatine (H3K27ac par CUT&Tag et ATACseq). Dans la tâche 2, nous établissons un modèle cellulaire inductible pour activer l’expression de DUXC dans les CSE bovines et en étudier les conséquences sur le transcriptome ainsi que la régulation du gène. Les cibles génomiques de DUXC seront déterminées. La tâche 3 étudie les liens entre l'activité de DUXC et l'acétylation des histones après induction de DUXC dans les cellules. Enfin, la dernière tâche étudie comment de petites molécules peuvent être utilisées pour moduler la reprogrammation de l'épigénome, avec l'objectif ambitieux de contrôler cette période clé et d'améliorer le développement embryonnaire in vitro.
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