Introduction
La cryoconservation du sperme est une technique essentielle pour la préservation de la diversité génétique et l'amélioration de la reproduction chez de nombreuses espèces, y compris les animaux d'élevage et les abeilles. La composition des solutions de décongélation joue un rôle crucial dans la survie et la fertilité des spermatozoïdes après la décongélation. Cet article explore les différents aspects de ces solutions, leur préparation, leur composition et leurs applications spécifiques, en mettant en évidence les facteurs clés qui influencent leur efficacité.
Préparation des Solutions de Décongélation
Température et Qualité de l'Eau
La préparation des solutions de décongélation nécessite une attention particulière à la température et à la qualité de l'eau utilisée. Par exemple, pour EquiPlus, la quantité requise doit être réchauffée entre +30°C et +35°C. L'EquiPlus liquide est fabriqué avec de l’eau pure, rendant l’ajout d’eau supplémentaire inutile.
Préparation du Sperme Réfrigéré
Le sperme fraîchement prélevé est maintenu à une température de +30°C à +33°C et analysé. Après avoir retiré le gel, son volume, la concentration et la motilité sont déterminés. Selon le nombre désiré de cellules mobiles progressives de sperme pour la dose d’’insémination, le montant nécessaire de dilution est calculé. La température de l’extendeur et du sperme doivent être égales au moment de la première dilution (+/-1°C). Le prolongateur est ajouté lentement en plusieurs mesures à l’éjaculat filtré, les 2 fractions doivent être doucement mais complètement mélangées.
Calcul du Volume Final de Sperme Étendu
Le calcul du volume final de sperme étendu est crucial pour obtenir une concentration optimale de spermatozoïdes mobiles par dose d'insémination.
Dilution Sans Centrifugation
Le taux de dilution optimal doit être d’au moins 1:3 (sperme : prolongateur), ou 25 millions de cellules spermatiques mobiles/ml après dilution finale. La quantité de sperme motile recommandée par dose d’insémination étant de 600 millions. Le volume inséminé devrait être de 10 à 30ml.
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Exemple :
- Volume de l’éjaculat = 45ml
- Concentration de sperme = 145 millions/ml
- Totale de spermatozoïdes dans l’éjaculat = 6525 milliards (6 525 x 109)
- Motilité = 60 %
- Spermatozoïdes motiles dans l’éjaculat = 3915 milliards
De cet éjaculat, 6 doses d’insémination peuvent être obtenues, chacune contenant 600 millions de spermatozoïdes (3915 milliards/600 millions = 6,5 doses). Pour arriver à une dilution optimale avec 25 millions de spermatozoïdes motiles/ml, le volume final doit être 156ml (3915 milliards/25 millions = 156,6ml). Chaque dose de sperme s’élèvera à 26ml (156 ml/6 doses= 26ml).
Dilution Avec Centrifugation
Le taux de dilution optimale et le nombre de spermatozoïdes mobiles par dose demeurent égaux. Le volume des doses peut être réduite (10 à 15ml).
Exemple :
- Volume de l’éjaculat = 45ml
- Concentration de sperme = 145 millions/ml
- Total de spermatozoïdes dans l’éjaculat = 6525 milliards de spermatozoïdes
- Motilité = 60 %
- Spermatozoïdes motiles dans l’éjaculat = 3915 milliards
Après centrifugation, décoller le surnageant (en laissant environ 1 ml de plasma séminal avec le culot centrifugé). 3-5 ml de dilution sont ajoutés délicatement pour re-suspendre le culot.
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Refroidissement et Conservation du Sperme
Après la dilution, le sperme n’est donc plus à tenir dans des conditions chaudes. Le taux de refroidissement recommandé est 0,05 à 0,1 °C/minute, respectivement pour 2h30 à 5 heures par rapport à la température ambiante à + 5°C. EquiPlus convient à la conservation du sperme jusqu'à 2 jours à environ + 5°C. Une analyse quotidienne de la qualité jusqu'à son utilisation est fortement recommandée.
Centrifugation
L’extendeur préparé et l’éjaculat exempt de gel sont mélangés 1 + 1. Une centrifugation est effectuée à 600 g pendant 15 minutes. Après cela, le surnageant doit être complètement éliminé et le culot est dissous dans 3-5 ml d'extendeur Beyond® (température ambiante). Assurez-vous que le culot et Beyond® ont la même température (généralement la température ambiante). Pour obtenir un rendement plus élevé de spermatozoïdes, une centrifugation peut être effectuée avec CushionFluid jusqu'à 1000 g pendant jusqu'à 20 minutes. L'éjaculat est placé sur une couche de 3-4 ml de CushionFluid dans le flacon de centrifugation. Après centrifugation, les spermatozoïdes sont situés dans une couche entre CushionFluid et le surnageant. CushionFluid et le surnageant doivent être éliminés avant tout traitement ultérieur.
Dilution Finale
Après centrifugation et remise en suspension avec Beyond®, le volume, la motilité et la concentration sont déterminés. Alternativement, la concentration est estimée en déduisant 20% de la concentration mesurée dans l'éjaculat natif, pour tenir compte de la perte moyenne lors de la centrifugation. Avec ces données, le volume requis d'extendeur Beyond® est calculé puis ajouté au culot remis en suspension (à température ambiante) pour la dilution finale.
Calcul du Volume Final de Sperme Dilué
Le taux de dilution optimal doit être compris entre 50 et 100 millions de spermatozoïdes/ml après dilution finale.
Exemple :
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- Volume d'éjaculat = 45 ml
- Concentration de sperme = 145 millions/ml
- Total de spermatozoïdes dans l'éjaculat = 6,525 milliards (6,525 x 109)
- Mobilité = 60%
- Spermatozoïdes mobiles dans l'éjaculat = 3,915 milliards
Données après centrifugation :
- Contenance = 10 ml
- Concentration de sperme = 522 millions/ml
- Total de spermatozoïdes = 5,22 milliards
- Mobilité = 60%
- Spermatozoïdes mobiles = 3,132 milliards
Calcul A (600 millions de spermatozoïdes par dose d'insémination) : 5 doses d'insémination peuvent être produites à partir de cet éjaculat avec 600 millions de spermatozoïdes mobiles par dose (3,132 milliards/600 millions = 5,22 doses). Le volume final sera de 100 ml avec un volume de 20 ml par dose d'insémination (5 x 20 ml), il faut donc ajouter 90 ml de Beyond®.
Calcul B (50 millions de spermatozoïdes par ml de dilution finale) : Le culot remis en suspension sera rempli jusqu'à 104 ml avec le dilueur Beyond® pour obtenir une dilution finale de 50 millions de spermatozoïdes/ml (5,22 milliards de spermatozoïdes/50 millions de spermatozoïdes par ml = 104,4 ml). Cinq doses de 20 ml ou 4 doses de 25 ml peuvent être produites à partir de l'éjaculat dilué.
Stockage du Sperme Dilué
Beyond® convient à la conservation de la semence d'étalon jusqu'à 14 jours à +5°C. La semence d'étalons connus pour être très sensibles au refroidissement peut être conservée à +17°C. L'augmentation de la température raccourcit le temps de stockage à un maximum de 7 jours.
Composition des Dilueurs de Sperme
Les dilueurs de sperme sont des solutions qui permettent d’ajuster la concentration en spermatozoïdes d’un éjaculat en augmentant son volume. Le dilueur a plusieurs rôles grâce à La présence de divers éléments :
- Nutritif : fructose, glucose
- Osmotique : NaCl, KCl
- Tampon : Tris
- Protecteur : antibiotiques
Les dilueurs les plus répandus contiennent du lait de vache demi-écrémé et/ou du jaune d’œuf que les semences soient fraîches ou congelées. Le dilueur doit posséder une osmolarité et un pH du même ordre que ceux du sperme. Il doit contenir des éléments capables de neutraliser les métabolites toxiques émis par les spermatozoïdes au cours de leur conservation, les systèmes tampon du lait remplissent bien ce rôle. Le lait contient des vitamines et autres anti-oxydants qui lui confèrent un rôle protecteur de l’oxydation. Le lait contient aussi des éléments qui protègent les spermatozoïdes contre les dégradations dues au froid (protéines et lactose) et des nutriments capables de subvenir aux besoins énergétiques des spermatozoïdes au cours de la conservation. Leur origine animale représente cependant un risque de transmission de maladies pour le sperme comme pour les animaux. Ainsi, des dilueurs synthétiques ou d’origine végétale sont en cours d’élaboration.
Cryoprotecteurs : Rôle et Types
Un cryoprotecteur est une substance qui est ajoutée avant congélation (à -80°C ou à -196°C) afin d’éviter la formation de cristaux à l’intérieur de la cellule et ainsi empêcher les dommages liés à la descente en température. Le cocktail de cryoprotecteurs choisis diffère selon le matériel biologique à cryoconserver, L’espèce du donneur et la méthode de cryoconservation utilisée.
Cryoprotecteurs Pénétrants
Les cryoprotecteurs pénétrants sont des solvants qui possèdent un faible poids moléculaire et sont majoritairement dérivés d’alcools. Comme leur nom l’indique, ils entrent à l’intérieur des cellules pour réduire leur déshydratation et l’apparition de cristaux de glace. Ces cryoprotecteurs sont toxiques pour les cellules d’où l’importance de limiter leur temps d’exposition afin de conserver toutes leurs fonctions.
- DMSO (Diméthylsulfoxyde) : liquide incolore d’odeur légèrement alliacée selon la pureté. Il est très hygroscopique et miscible à l’eau, l’éthanol et l’acétone. Il peut être utilisé comme antigel et comme cryoprotecteur. Le DMSO est très utilisé en cryoconservation. Attention : ce solvant polaire entre très rapidement dans les cellules et peut de ce fait être néfaste s’il a été mis en contact avec des contaminants. Ses propriétés hygroscopiques font qu’il doit être conservé dans des récipients hermétiques ou dans un dessiccateur.
- Glycérol : liquide incolore, visqueux et inodore. Il est faiblement toxique et est utilisé dans de nombreuses compositions pharmaceutiques. Ce liquide est soluble avec l’eau, facile à manier et a un rôle d’antigel biologique. Ce cryoprotecteur est le plus couramment utilisé dans le processus de préparation des paillettes. Attention : le glycérol peut causer des chocs osmotiques lors de la décongélation.
- Ethylène glycol : Liquide hygroscopique (soit capable d’absorber l’humidité de l’air) et incolore. Tandis qu’il est soluble dans l’eau, l’éthanol, et l’acétone, il est insoluble dans l’oxyde de diéthyle, le sulfure de carbone, les hydrocarbures halogénés et les huiles. Ce cryoprotecteur est généralement utilisé comme matière de base des antigels et des liquides de réfrigération.
- Propanediol (ou propylèneglycol) : liquide incolore, légèrement visqueux, peu volatil et pratiquement inodore. Tout comme l’éthylène glycol, ce liquide hygroscopique est soluble dans l’eau, l’éthanol, l’acétone.
Cryoprotecteurs Non Pénétrants
Les cryoprotecteurs non pénétrants se divisent en deux groupes : polymères et sucres. Ces solvants possèdent respectivement de hauts et faibles poids moléculaires. Ils ne rentrent jamais dans les cellules lors de la préparation à la cryoconservation. Leur forte concentration extracellulaire permet la déshydratation intracellulaire et évite la cristallisation. De même, ils permettent une protection de la membrane plasmique des cellules à cryoconserver en interagissant avec celle-ci.
- Dextran : polymère ramifié de monomères de glucose. Ce sucre est naturellement produit par certains organismes.
- Lactose : sucre naturellement présent dans les produits laitiers. Il est composé de deux monomères glucidiques que sont le glucose et le galactose. Ce composé est de couleur blanche et sa solubilité dans l’eau est moindre que celle du sucrose et du glucose.
- Polyéthylène glycol : polymère fabriqué à partir de monomères d’éthylène glycol (dérivé d’alcool). C’est un liquide visqueux incolore, il est soluble dans l’eau, l’alcool et l’acétone.
- Polyvinylpyrrolidone (polyvidone ou povidone) : polymère issu de la polymérisation de la N-vinylpyrrolidone. Il est soluble dans l’eau, l’acide acétique, l’éthanol, le glycérol.
- Saccharose ou sucrose : sucre composé de deux monomères, un monomère de glucose et un monomère de fructose. Ce n’est pas un cryoprotecteur hygroscope mais permet de protéger la cellule de la cryoconservation en évacuant l’eau intracellulaire.
Cryoconservation du Sperme d'Abeille : Un Cas Spécifique
Le mode de reproduction des abeilles induit des difficultés pour le sélectionneur. La production de sperme limitée à quelques jours doit en effet suffire pour la fécondation des oeufs durant toute la vie de la reine. Les récents progrès dans le domaine de cryoconservation apportent ici des réponses prometteuses.
Contexte et Enjeux
L’idée première est de conserver après leur mort les allèles des reines les plus performantes en les cryogénisant. L’enjeu est la préservation de la biodiversité et des caractères rares, comme la résistance au varroa. Le nombre d’accouplements serait accru et le risque de consanguinité réduit.
Caractéristiques du Sperme d'Abeille
Le spermatozoïde des abeilles possède une caractéristique remarquable puisqu’il reste vivant et fertile de longues semaines, une propriété indispensable à l’insémination des reines qui « piochent » au fur et à mesure dans sa spermathèque pour féconder ses oeufs. En collaboration avec l’Institut de Recherches sur les Animaux Sauvages de Berlin ainsi que l’université de Leipzig, le laboratoire d’Hohen Neuendorf (Allemagne) a démontré que cette longévité est probablement due en partie à la composition des membranes cellulaires, extrêmement pauvres en acides gras polyinsaturés.
Historique de la Recherche
Les chercheurs soviétiques puis américains se sont très vite intéressés à cette technique de conservation par le froid. Le sperme du faux-bourdon est ainsi congelé à -160° (azote) puis décongelé vivant. Étonnamment, celui-ci est alors beaucoup plus actif. Mais, après insémination, le nombre de cellules retrouvées dans la spermathèque était faible et la durée de vie de la reine réduite. L’Université de Washington a ensuite amélioré le processus, puis l’INRA d’Avignon dans les années 2000.
Défis et Solutions
En 2009, l’Institut de Recherches Apicoles de Hohen Neuendorf s’est intéressé au sujet avec l’appui de PME locale (AMP-Lab GmbH) et du Ministère de l’Agriculture allemand. Ils se sont alors demandé si l’état très actif des spermatozoïdes après décongélation n’était pas un problème. La solution a donc consisté à mettre en place une méthode pour ajouter les cryoprotectants (additif évitant aux cellules de geler) non pas par dilution, mais par dialyse.
Le taux d’ouvrières pondu par les reines inséminées est alors supérieur à 50 %. « Ces résultats ne permettent évidemment pas encore l’utilisation de sperme décongelé pour l’insémination de reines « de production », mais ils sont suffisants pour les inséminer avec du sperme congelé et obtenir qu’elles-mêmes produisent des oeufs fécondés. »
Kits de Cryogénisation
En 2014, l’institut d’Hohen Neuendorf a développé un kit commercial de cryoconservation. Mais compte tenu de la complexité du procédé et des risques liés à la manipulation de l’azote, il est plutôt conseillé aux sélectionneurs intéressés de s’adresser soit à un institut public, soit aux futures cryobanques privées. La première a été créée aux États-Unis.
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