Fécondation In Vitro chez les Équidés : Tout Savoir sur cette Révolution en Reproduction Équine

Introduction

La fécondation in vitro (FIV) est une technique de reproduction assistée qui consiste à mettre en contact des gamètes femelles (ovocytes) et mâles (spermatozoïdes) dans un environnement de laboratoire contrôlé. Cette méthode, initialement développée pour pallier les problèmes de fertilité chez l'humain, a trouvé des applications significatives dans le domaine de la reproduction équine. Cet article explore en détail la définition, les étapes clés, les avantages, les applications pratiques et les perspectives d'avenir de la FIV chez les équidés.

Définition de la Fécondation In Vitro (FIV)

La fécondation in vitro (FIV) est une technique de reproduction assistée qui consiste à mettre en contact des gamètes femelles, les ovocytes, et des gamètes mâles, les spermatozoïdes. Cette mise en contact s'effectue dans un milieu artificiel en laboratoire, en dehors de l’oviducte de la jument.

Étapes Clés de la FIV chez les Équidés

1. Obtention des Ovocytes

Pour être fécondés, les ovocytes doivent être matures. En effet, l’ovaire de juments porte de nombreux petits follicules qui contiennent chacun un ovocyte immature. Au cours du cycle, un follicule va poursuivre sa croissance jusqu’au stade préovulatoire puis ovuler. Lors de l’ovulation du follicule préovulatoire, l’ovocyte mature est libéré dans l’oviducte où il pourra être fécondé. Pour réaliser une FIV, il faut donc avoir des ovocytes matures. Pour cela, deux alternatives sont envisageables :

Collecte d'ovocytes matures: Les ovocytes matures peuvent être collectés dans des follicules préovulatoires juste avant l’ovulation, par ponction folliculaire sous contrôle échographique.
Maturation in vitro (MIV): Les ovocytes matures peuvent être obtenus après collecte d’ovocytes immatures dans les petits follicules par ponction folliculaire sous contrôle échographique puis maturation in vitro. La maturation in vitro est réalisée par culture des ovocytes immatures dans un milieu artificiel (milieu de culture commercial additionné d’hormones, de sérum et/ou de facteurs de croissance) dans un incubateur permettant un environnement adapté à la culture cellulaire (5% de CO2 dans l’air, 38,5°C, 100% d’humidité).

2. Préparation des Spermatozoïdes (Capacitation)

Pour féconder un ovocyte, les spermatozoïdes doivent être capacités. En effet, lors d’une saillie ou d’une insémination artificielle, les spermatozoïdes remontent le tractus génital femelle (utérus et oviducte) et subissent de nombreuses modifications qui leur permettent d’acquérir leur pouvoir fécondant. Ces modifications sont appelées capacitation. Pour réaliser une fécondation in vitro, il faut donc avoir des spermatozoïdes capacités. Le sperme collecté sur un étalon à l’aide d’un vagin artificiel n’est pas capacité, il doit donc subir un traitement de capacitation in vitro.

3. Fécondation et Culture Embryonnaire

Lors de la fécondation in vitro, les gamètes femelles, les ovocytes et les gamètes mâles, les spermatozoïdes, sont mis en contact dans un milieu favorisant leur interaction (milieu de culture commercial additionné d’hormones, de sérum, de sucres et/ou d’albumine). Puis ce milieu est placé dans un incubateur permettant un environnement adapté à la culture cellulaire : 5% de CO2 dans l’air, 38,5°C, 100% d’humidité (figure 1). Après quelques heures de co-incubation avec les spermatozoïdes, les ovocytes sont fécondés. Les embryons obtenus peuvent être transférés immédiatement dans l’oviducte d’une jument receveuse par chirurgie ou cultivés in vitro dans un milieu adapté au développement des embryons pendant quelques jours (figure 1) puis transférés dans l’utérus d’une jument receveuse. Depuis 2011, l'équipe de l'INRA de Nouzilly et ses collaborateurs développe une technique de FIV qui permet d’atteindre 64% d’ovocytes fécondés en moyenne, la plupart étant au stade embryon à 1 cellule.

4. Transfert d'Embryon

Les embryons obtenus par FIV peuvent être transférés de deux manières :

Transfert immédiat: Les embryons sont transférés directement dans l’oviducte d’une jument receveuse par chirurgie.
Culture in vitro et transfert: Les embryons sont cultivés in vitro pendant quelques jours dans un milieu adapté, puis transférés dans l’utérus d’une jument receveuse.

Avantages de la Fécondation In Vitro

La technique de fécondation in vitro permet la production d’embryons in vitro et présente deux avantages principaux:

Utilisation d'embryons jeunes: D’abord, les embryons étant cultivés in vitro, ils peuvent être sortis de leur boite de culture et utilisés à n’importe quel stade de développement. Il est donc possible d’utiliser de jeunes embryons de petit diamètre, qui ont un meilleur taux de survie après congélation par les techniques classiques que les embryons collectés in vivo dans l’utérus à partir de 6,5 jours post-ovulation.
Production de plusieurs embryons: Ensuite, la production d’embryons in vitro permet de produire plusieurs embryons par cycle en collectant plusieurs ovocytes immatures par ponction folliculaire. Les ovocytes sont soumis à une maturation et fécondation in vitro, puis les embryons produits sont cultivés in vitro, congelés et/ou transférés dans une femelle receveuse.

Applications Pratiques de la FIV chez les Équidés

En raison de ces avantages, la technique de FIV offre plusieurs applications pratiques décrits ci-après:

1. Reproduction d'Animaux de Haute Valeur Génétique avec Fertilité Réduite

Lorsque les reproducteurs ont une grande valeur génétique mais sont peu ou pas fertiles, la production d’un embryon nécessite des techniques de procréation assistée, et notamment la fécondation in vitro.

Juments avec problèmes d'ovulation ou de transport embryonnaire: Pour des juments présentant des problèmes d’ovulation (lutéinisation du follicule préovulatoire avant l’ovulation par exemple), des problèmes au niveau de l’oviducte (remontée des spermatozoïdes, transport de l’ovocyte ou de l’embryon altérés) ou de l’utérus (transport, survie ou implantation de l’embryon altérés), il est possible de collecter des ovocytes dans l’ovaire et de réaliser une FIV.
Étalons avec sperme de faible qualité: Pour des étalons ayant un sperme peu concentré, riche en spermatozoïdes anormaux, ou des spermatozoïdes ayant une faible mobilité qui altère leur remontée dans le tractus femelle, il est possible de collecter le sperme, de le concentrer et de réaliser une FIV. Les embryons obtenus peuvent ensuite être transférés dans une jument receveuse par transfert d'embryon.

2. Gestion Optimisée de la Carrière Sportive des Reproducteurs

La gestion raisonnée de la carrière sportive du cheval laisse parfois peu ou pas de temps pour la reproduction. Une jument qui pourrait produire sur un cycle de reproduction plusieurs embryons transférés dans des juments receveuses ou congelés dans l’attente d’un transfert, serait ensuite disponible pour une carrière sportive. La production de plusieurs embryons sur un cycle n’est pas envisageable par l’administration d’un traitement de superovulation, car les techniques de superovulation disponibles en élevage sont peu efficaces et le nombre d’embryons collectés reste limité. De plus, il n’est pas possible de collecter des jeunes embryons, puisque les embryons équins ne descendent dans l’utérus que vers 6,5 jours, et la plupart de ces embryons ont atteint un stade où leur taux de survie après congélation classique est faible. Par contre, la production de plusieurs jeunes embryons sur un cycle est envisageable par collecte de plusieurs ovocytes immatures par ponction folliculaire, maturation in vitro, fécondation in vitro et culture in vitro des embryons.

3. Sauvegarde des Espèces Menacées et Maintien de la Biodiversité

La plupart des équidés sauvages sont actuellement menacés de disparition. C'est le cas par exemple du zèbre de Grevy ou de l’âne sauvage d’Asie. De plus, plusieurs races d’équidés domestiques sont en voie d’extinction, avec moins de 100 femelles en activité en 2013. C’est le cas par exemple pour le poney Landais, l’âne Bourbonnais, l’âne de Provence, le Grand Noir du Berry, l’âne Normand, etc. La fécondation in vitro est un outil pour la préservation de la biodiversité des équidés, via d’une part la préservation du patrimoine génétique existant et d’autre part la sauvegarde des races en voie d’extinction. La préservation du patrimoine génétique existant nécessite la préservation de la lignée mâle par congélation du sperme et la préservation de la lignée femelle par congélation des ovocytes et/ou des embryons. Dans l’espèce équine, la préservation de la lignée femelle n’est pas encore totalement maîtrisée. Dans l’espèce asine, ni la préservation de la lignée mâle, ni celle de la lignée femelle ne sont maîtrisées. La production d’embryons in vitro permet d’obtenir de jeunes embryons qui ont un meilleur taux de survie après congélation par les techniques classiques que les embryons de grande taille collectés in vivo dans l’utérus à partir de 6,5 jours post-ovulation. D’autre part, la sauvegarde des races en cours d’extinction nécessite la production de nombreux embryons à partir des animaux restants. Si le nombre de femelles est limité, il est alors urgent de produire un grand nombre d’embryons dans un temps court. Les traitements de superovulation étant peu efficaces, la production de plusieurs embryons sur un cycle est envisageable par collecte de plusieurs ovocytes immatures par ponction folliculaire, maturation puis fécondation in vitro et culture in vitro des embryons. Les embryons peuvent ensuite être transférés dans une femelle receveuse d’une race proche ou congelés dans l’attente d’un transfert.

4. Test de la Qualité des Gamètes

De plus, la FIV est un excellent outil pour tester la qualité des gamètes. En effet, la qualité du sperme d’un étalon est estimée actuellement par des mesures de concentration, de mobilité et de pourcentage de spermatozoïdes anormaux. Cependant, les tests actuellement disponibles sont peu corrélés à la fertilité de l’étalon. Le meilleur critère de qualité du sperme est l’aptitude des spermatozoïdes à féconder un ovocyte. La FIV permet de mesurer le pourcentage d’ovocytes fécondés pour un éjaculat donné, soit en sperme frais, soit après congélation du sperme. C’est un critère supplémentaire pour l’évaluation du sperme d’un étalon ou l’évaluation d’une technique de conservation du sperme. La fécondation in vitro peut aussi permettre de tester la qualité des ovocytes d’une jument infertile malgré des ovulations normales.

5. Production d'Embryons pour la Recherche Appliquée

La FIV permet de fournir les embryons nécessaires pour la recherche appliquée. En effet, les pertes embryonnaires précoces sont une cause importante d’infertilité. Elles sont dues en partie à des anomalies de fécondation et/ou de développement précoce au niveau de l’oviducte. Ces étapes étant peu accessibles in vivo, la production d’embryons par FIV permet d’étudier in vitro la fécondation et le développement embryonnaire pour identifier les périodes critiques et les causes d’arrêt du développement. De plus, la mise au point des techniques de congélation/vitrification des embryons équins est limitée par le faible nombre d’embryons disponibles pour les études. La fécondation in vitro permet d’augmenter le nombre d’embryons pour les expérimentations et d’accélérer l’avancée de la recherche.

Historique de la FIV chez les Équidés

1989: Les premiers travaux publiés concernant la FIV datent de 1989, au Colorado, dans l’équipe d’A. McKinnon et E. Squires.
1990: La première gestation après fécondation in vitro a été obtenue en 1990 en France dans le laboratoire d’E. Palmer, M. Magistrini, J. Bézard et G. Duchamp.
1991: Le premier poulain est né en 1991. Il a été obtenu à partir d’ovocytes matures et de sperme frais traité à l’ionophore calcique. Cette technique de FIV a permis d’obtenir 30% d’ovocytes fécondés.
1996: L’équipe italienne de M.E. Dell’Aquila et G. Lacalandra a développé une technique de FIV à partir d’ovocytes immatures et de sperme congelé traité à l’héparine. Elle a permis d’atteindre 32% d’ovocytes fécondés.
2009: L’équipe américaine de L. McPartlin et S. Bedford-Guaus a publié une technique de FIV à partir d’ovocytes immatures et de sperme frais traité à la procaïne. Elle a permis d’atteindre 61% d’ovocytes fécondés. La même année, notre équipe (S. Mugnier, C. Douet, G. Duchamp, G. Goudet) a montré que la présence de cellules ou de sécrétions d’oviducte lors de la FIV améliorait les taux de fécondation in vitro.
Depuis 2011: L'équipe de l'INRA de Nouzilly développe une technique de FIV qui permet d’atteindre 64% d’ovocytes fécondés en moyenne. Les ovocytes immatures collectés sont soumis à une maturation in vitro puis une incubation en présence de fluide d’oviducte. Du sperme frais collecté qui est traité à la procaïne. Après FIV, 64% d’ovocytes fécondés sont obtenus en moyenne. Après 48 heures de culture, la plupart des embryons sont au stade 1 cellule contenant 2 pronoyaux (figure 5) : un pronoyau femelle contenant l'ADN de l’ovocyte et un pronoyau mâle contenant l'ADN du spermatozoïde. Quelques embryons se sont clivés et sont au stade d’embryons à 2 ou 4 cellules. Cependant, ils ne poursuivent pas leur développement lors d'une culture in vitro plus longue. La qualité de ces embryons doit être améliorée afin d’obtenir des gestations après transfert dans une femelle receveuse.

ICSI : Une Variante de la FIV

L’intra-cytoplasmic sperm injection (ICSI) est une biotechnologie de la reproduction qui consiste à injecter un spermatozoïde directement dans un ovocyte mature (c’est-à-dire apte à la fécondation). Ce dernier, ainsi fécondé, est mis en développement in vitro pendant une semaine jusqu’à atteindre le stade blastocyste. L’embryon est ensuite réimplanté immédiatement dans une jument receveuse ou congelé dans l’azote liquide pour un transfert ultérieur. Cette technique n’est pas spécifique à l’espèce équine. Elle est notamment utilisée en médecine humaine lorsque la fécondation in vitro (FIV) classique n’est pas utilisable (faible qualité de semence).

Étapes de l'ICSI

Récolte des ovocytes: Les ovocytes sont récoltés par ponction transvaginale écho-guidée. La jument donneuse est placée dans une barre de contention et est tranquillisée et analgésiée afin d’éviter toute douleur. Un premier opérateur introduit dans le vagin une sonde échographique et va en parallèle, via le rectum, maintenir l’ovaire et le placer devant cette sonde de manière à pouvoir voir les tissus ovariens sur l’échographe. Un second opérateur va introduire, dans un guide situé le long de la sonde échographique, une aiguille permettant de transpercer les follicules et d’aspirer le liquide folliculaire pour récupérer les ovocytes. Les ovocytes équins étant attachés à la paroi du follicule, il est nécessaire de procéder par rinçages successifs de la cavité folliculaire et, par des mouvements rotatifs de l’aiguille, l’opérateur va gratter la paroi du follicule. Un troisième opérateur s’assure du confort de la jument et reste vigilant au moindre signe de souffrance de l’animal. Il pourra être amené à réaliser de nouvelles injections de tranquillisant et/ou analgésiant. Cette personne peut également transmettre les fluides collectés au fur et à mesure au laboratoire.
Recherche des ovocytes: Une fois collectés, les liquides sont filtrés puis observés sous loupe binoculaire placée dans une hotte à flux laminaire horizontal pour rester dans un environnement stérile.
Maturation in vitro: Les ovocytes immatures récoltés sont mis en maturation dans des conditions atmosphériques particulières (5% de CO2, 38,5°C) pendant 28 à 30 heures. L’objectif de cette étape est l’obtention d’un ovocyte apte à la fécondation, correspondant au stade métaphase II, où une partie du matériel génétique a été expulsé dans le globule polaire.
Injection du spermatozoïde: Grace à un système de micromanipulateurs montés sur un microscope, l’ovocyte est maintenu en place et un spermatozoïde est injecté directement à l’intérieur via une pipette d’injection. Au préalable de cette injection, les spermatozoïdes sont ralentis dans un milieu visqueux et leur flagelle est immobilisé pour permettre leur aspiration dans la pipette et l’injection sans risquer de provoquer des dégâts sur le cytosquelette du cytoplasme.
Développement in vitro: Une fois l’injection du spermatozoïde dans l’ooplasme réalisée, les ovocytes fécondés sont de nouveau placés dans un incubateur. La culture va durer au minimum 7 jours dans une atmosphère à 5% de CO2 et 5% d’O2, à une température de 38,5°C.

Taux de réussite de l'ICSI

Chiffres publiés par le laboratoire Avantea du Pr Galli en Italie:

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Le taux de collecte des ovocytes par ponction transvaginale sur des follicules immatures est en moyenne de 50%. Il peut atteindre 60% pour une équipe de ponction expérimentée avec du matériel performant.
Le taux de maturation in vitro des ovocytes se situe entre 65 et 70% si les ovocytes sont mis en incubateur à la suite de la collecte. Ce taux est légèrement inférieur (55-60%) si les ovocytes sont transportés 24 heures avant l’incubation.
Après la fécondation par ICSI, le taux de blastocystes obtenus lors du développement in vitro est beaucoup plus faible, de l’ordre de 17 à 20%.
Au final, le nombre de blastocystes obtenus en moyenne par séance de ponction est de 1,2.

Facteurs influant sur la réussite de l'ICSI

Plusieurs facteurs peuvent influencer négativement les résultats:

La qualité de l’ovocyte diminue avec l’âge de la jument donneuse.
La saison peut également influer. Les résultats sont diminués lors de l’anoestrus profond de la jument.
La qualité de la semence de l’étalon utilisé peut aussi entrer en ligne de compte ou encore le nombre d’étalons utilisés sur une même séance d’ICSI, entraînant un temps de préparation de la semence plus long et donc un temps d’attente des ovocytes également plus long.
Il y a un effet « jument » inévitable.

Considérations Pratiques

Dans le centre de prélèvement, un circuit spécifique à ces juments doit être appliqué. Elles doivent être hébergées dans une écurie ou un paddock dédié(e) et ne pas être en contact avec des chevaux de statut sanitaire inférieur. Aujourd’hui, quelques centres réalisent des ponctions transvaginales écho-guidées en France. Les ovocytes sont ensuite conditionnés dans un milieu spécifique et envoyés à l’étranger, notamment en Italie, dans des laboratoires spécialisés réalisant la technique d’ICSI en routine. Les blastocystes obtenus sur place au laboratoire peuvent être soit transférés immédiatement si le centre réalise des transferts d’embryons, soit congelés et donc renvoyés en France pour leur transfert ultérieur. En ce qui concerne la procédure d’ICSI, il n’existe pas à ce jour de laboratoire spécialisé en France. Plusieurs centres sont équipés du matériel de micromanipulation mais le geste technique d’ICSI nécessite un long apprentissage pour être totalement maîtrisé. L’utilisation de la ponction ovocytaire est une technique assez invasive qui n’est pas sans risques. Même si ceux-ci sont faibles, il est important de noter : atteinte de l’ovaire, infection de l’ovaire ou de l’abdomen, problèmes suite aux injections médicales. Face à l’engouement de la filière pour cette technique, les étalonniers s’organisent et proposent maintenant des contrats de vente de paillettes spécifiquement pour l’ICSI. Du côté du SIRE, des réflexions sont menées pour pouvoir permettre de déclarer des naissances plusieurs années après la conception de l’embryon. Dans une étude rétrospective sur 559 embryons issus d’ICSI, il a été montré que la jument receveuse doit être à J+4 post-ovulation pour être dans les conditions optimales de réimplantation d’un embryon issu d’ICSI congelé (Cuervo-Arango et al., 2019). Une autre étude récente montre que les embryons issus d’ICSI congelés donnent un pourcentage plus faible de gestation et de poulinage par rapport aux embryons in vivo frais, et significativement plus de mâles.

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Fécondation In Vitro (FIV) chez les Équidés: Définition, Applications et Perspectives