La lyse ovocytaire est un phénomène qui peut survenir dans le contexte de la procréation médicalement assistée (PMA), plus précisément lors de la manipulation et de la conservation des ovocytes. Comprendre ce phénomène et ses causes est essentiel pour optimiser les techniques de PMA et améliorer les chances de succès pour les couples ou les femmes célibataires qui y ont recours. Ces techniques de PMA sont dites « in vitro » puisque la fécondation se passe en dehors du corps de la femme.
La PMA et la Manipulation des Ovocytes
Dans le cadre de la PMA, les ovocytes sont prélevés des ovaires de la femme, souvent après une stimulation ovarienne. L’objectif de la stimulation, un traitement hormonal administré par injection, est d’une part d’obtenir le développement simultané de plusieurs follicules et d’autre part de pouvoir prélever des ovocytes avant l’ovulation. Ce traitement est surveillé de façon adaptée par des échographies et des dosages hormonaux. Lorsque les follicules seront matures, le déclenchement de l’ovulation. Elle est réalisée par voie vaginale sous contrôle échographique, et sous anesthésie ou analgésie. Après la ponction, les liquides folliculaires contenant les ovocytes (ou ovules) sont transmis au laboratoire. Tous les follicules. Le recueil du sperme par masturbation a lieu au laboratoire. Le sperme est ensuite préparé sur place le jour de la ponction ovarienne. Dans des situations particulières, des spermatozoïdes préalablement congelés seront utilisés.
Après le recueil et la préparation, les spermatozoïdes sont simplement déposés au contact des ovocytes dans une boîte de culture contenant un milieu liquide nutritif et placée dans un incubateur à 37° C. Les spermatozoïdes mobiles viennent spontanément, sans aide extérieure, au contact de l’ovocyte. Un seul spermatozoïde fécondera celui-ci. Dans certaines situations, la technique de la FIV peut être associée à l’ICSI : un seul spermatozoïde. Le lendemain de la ponction, les ovocytes fécondés (ou zygotes) sont identifiables par la présence de 2 noyaux, appelés pronucleï : l’un provient de l’ovocyte, l’autre du spermatozoïde. Tous les ovocytes ne sont pas forcément fécondés. Les zygotes deviennent des embryons de deux à quatre cellules en 24 heures, puis de six à huit cellules 24 heures plus tard. Dans la majorité des cas, les embryons sont transférés deux à trois jours après la ponction dans l’utérus. Le transfert embryonnaire est un geste simple et indolore qui est parfois pratiqué sous contrôle échographique. Il est réalisé au moyen d’un cathéter fin et souple introduit par voie vaginale dans l’utérus, la patiente étant allongée en position gynécologique. L’embryon est déposé à l’intérieur de l’utérus.
Le nombre d’embryons obtenus peut être supérieur au nombre d’embryons transférés. Dans ce cas, les embryons non transférés dits « surnuméraires » et qui présentent des critères de développement satisfaisants peuvent être congelés. Ces embryons, après décongélation, pourront être placés dans l’utérus. Il peut arriver que le processus soit interrompu pour diverses raisons (non-réponse des ovaires à la stimulation, maturité des ovocytes (ou ovules), caractéristiques du sperme, potentiel évolutif des embryons. Malgré toutes les précautions mises en place, la possibilité d’une altération de la qualité du sperme, des ovocytes ou des embryons. Des effets indésirables peuvent survenir en cours de traitement. On observe généralement un taux légèrement plus élevé de poids de naissance inférieur à la normale et de naissances prématurées chez les enfants conçus par FIV. Comme tout geste chirurgical, la ponction ovarienne.
Définition de la Lyse Ovocytaire
La lyse ovocytaire se réfère à la destruction ou à la désintégration de l'ovocyte. Ce phénomène peut se produire à différentes étapes de la PMA, notamment lors de la congélation (cryoconservation) et de la décongélation des ovocytes. La lyse peut être partielle ou totale, et elle compromet la viabilité de l'ovocyte, le rendant inutilisable pour la fécondation.
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Causes de la Lyse Ovocytaire
Plusieurs facteurs peuvent contribuer à la lyse ovocytaire :
La Congélation et la Vitrification
Le principe de la congélation, que ce soit pour l’ovocyte ou l’embryon repose sur le passage de l’eau intra et extra cellulaire de l’état de phase liquide à l’état solide (ou vitreux) en utilisant des agents moléculaires dits cryoprotecteurs (CPs). Le rôle majeur de ces CPs sera de se substituer à l’eau intracellulaire (CPs pénétrants) en créant un gradient osmotique à l’aide d’un sucre non pénétrant (en général, le sucrose). Il existe deux procédures de congélation, la congélation lente et la vitrification. La différence principale réside en l’augmentation de la concentration en CPs lors de la vitrification qui permettra une vitesse de descente en température ultra rapide, évitant le réarrangement moléculaire de l’eau à savoir la phase cristalline. La cristallisation aléatoire de l’eau dans l’échantillon congelé est en effet principalement responsable du phénomène de lyse partielle ou totale de l’ovocyte ou embryon congelé. Observée au décours de la décongélation, cette lyse définit les paramètres qualifiant l’efficacité biologique de la procédure, à savoir principalement : le taux de survie intacte (TSI) (% d’ovocytes et/ou embryons ayant résisté totalement). Aujourd’hui, la vitrification a largement supplanté la congélation lente et permet d’atteindre un TSI >80% concernant l’ovocyte et >90% pour l’embryon, à tous les stades de son développement.
Congélation Lente (CL)
Brièvement, la CL des embryons repose sur une descente lente en température de 20°C à - 30°C après exposition longue à des concentrations faibles et croissantes en CPs (protocole le plus fréquent : 1,5M propane 1-2 diol, sucrose 0,1M ; -2°C/minute de 20°C à -7°C, cristallisation induite (seeding), -0,3°C/minute de -7°C à -30°C puis plongée dans l’azote liquide). Le même protocole de CL a longtemps été utilisé pour les ovocytes mais une augmentation de la concentration en sucrose à 0,2 ou 0,3M a montré sa supériorité (Gook and Edgar. 2007). Dans tous les cas, la CL utilise un support fermé évitant le contact direct entre l’échantillon et l’azote liquide. A ce stade, la descente en température de 20°C à - 196°C, de toute façon ultra rapide, dépend du type de supports utilisés. Cette notion a son importance. En effet, plus la vitesse de refroidissement est rapide et plus on évite le réarrangement moléculaire de l’eau, en l’occurrence la formation de cristaux de glace. Il est démontré que l’aptitude d’un embryon à s’implanter lors de son transfert intra-utérin et après avoir subi le processus de congélation/décongélation se résume à sa survie et ainsi, plus il a survécu de façon intact, plus ces chances sont bonnes (Edgar et al., 2007). En effet, une méta analyse récente montre qu’aux stades précoces (Jours (J) 2 ou 3), le TS était respectivement de 84% après CL et 98% après vitrification (Loutradi et al.,2008). Cette différence était significative (p=0.0002). La même étude montrait une différence encore plus importante (75 vs. 90% ; p3 (à J2) et >6 (à J3) blastomères et <30% de fragmentation cytoplasmique (dépourvus de blastomères multinucléés).
Vitrification
Les étapes de congélation et décongélation ont été effectuées en utilisant les kits Irvine et les paillettes CryoBioSystem en suivant les instructions des fabricants. Les données obtenues ont été comparées à une série rétrospective de 189 cycles de décongélation après CL effectuées de Janvier à Octobre 2010 en utilisant les kits Medicult. Le critère de jugement principal était les TS et TSI. Au total, 87 et 412 embryons ont été décongelés après vitrification (1.50 +/- 0.63 par décongélation) et CL (2.18 +/- 1.35), respectivement (p=0.0002). Nous avons observé une différence hautement significative respectivement des TS et TSI après décongélation des embryons vitrifiés lorsque comparé aux embryons décongelés issus d’une CL (98.3 +/- 13.1% vs. 77.3 +/- 32.0%, p<10-4 ; 88.2 +/- 28.3% vs. 47.7 +/- 41.4%, p<10-4). Par ailleurs, le taux de grossesses par cycle de décongélation embryonnaire était respectivement de 32.7% (19/58) et 18.5% (35/189) (p=0.03) en faveur du groupe des embryons décongelés après vitrification.
Sensibilité de l'Ovocyte
La problématique de la congélation de l’ovocyte est liée à sa forte teneur en eau, ce qui rend cette cellule très sensible aux variations de température. Ainsi, pratiquement toutes les données disponibles comparent les issues biologique et clinique des ovocytes frais avec celles des ovocytes ayant subi la vitrification en système ouvert, système permettant en théorie de minimiser le temps de passage à la phase cristalline. Une issue comparable des ovocytes frais ou vitrifiés a été rapportée dans plusieurs études prospectives randomisées, que ce soit pour le modèle du don d’ovocyte (Cobo et al. 2008 ; Cobo et al., 2010) ou les ovocytes vitrifiés au décours d’un programme d’AMP intraconjugal (Rienzi et al., 2010). La conclusion des auteurs est ainsi que la vitrification des ovocytes en système ouvert aboutit non seulement à un excellent taux de survie des ovocytes congelé mais aussi que ses « compétences » ne sont pas altérées par cette procédure. A l’inverse, une étude prospective longitudinale, incluant les résultats de 234 cycles de FIV/ICSI cumulés avec ceux de 256 cycles de décongélation d’ovocytes congelés par CL avec 0.3M de sucrose, a montré un TSI de 72.8% (Magli et al., 2010). De plus, les auteurs décrivent une altération de l’issue biologique des ovocytes ayant survécu après ICSI avec notamment une qualité embryonnaire et une capacité de développement jusqu’au stade blastocyste significativement diminuée lorsque comparée avec les ovocytes frais.
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Systèmes de Vitrification
De façon très intéressante, une étude très récente a comparé en utilisant la même méthodologie longitudinale l’efficacité de la vitrification des ovocytes par les systèmes « ouvert » et « fermé ». Ainsi, les issues biologiques de 48 et 49 cycles frais ont été comparées à celles de 51 et 53 cycles de décongélations utilisant un système ouvert (Cryotop) et fermé (Cryotip), respectivement (Paffoni et al., 2011). Les auteurs confirment une issue biologique comparable des ovocytes vitrifiés avec un système ouvert par rapport aux ovocytes frais. Les résultats comparés de l’issue biologique des ovocytes vitrifiés en système ouvert ou système fermé montrent que le TSI est nettement supérieur pour les ovocytes vitrifiés en système ouvert (82.8%) comparé au recours au système fermé (57.9% ; p=0.001). Ainsi, la vitrification des ovocytes en système ouvert semble montrer sa supériorité lorsque comparé à la fois à la CL ou à la vitrification en système fermé. Ce type de risque est difficile à documenter et s’appuie essentiellement sur le principe de précaution, d’ailleurs extrêmement codifié en France depuis l’affaire du sang contaminé. Ainsi, seul le système fermé est autorisé en France malgré la supériorité attendue du système ouvert.
Manipulation des Ovocytes
Les manipulations physiques des ovocytes, comme l'ICSI (injection intracytoplasmique de spermatozoïdes), peuvent également endommager les ovocytes et entraîner leur lyse. L’objectif principal de la ponction ovarienne, qu’elle suive une stimulation hormonale ou une maturation in vitro (MIV), est de recueillir le nombre adéquat d’ovocytes. Les ovocytes matures, au stade métaphase 2 de méiose, sont obtenus le jour de la ponction pour une stimulation et jusqu’à 48 heures après cette ponction concernant la MIV (après incubation dans un milieu de culture adapté). Si la femme n’est pas en couple au moment de la préservation de sa fertilité, seule la vitrification des ovocytes matures sera effectuée au laboratoire. Si cette femme est en couple, l’option de féconder tout ou partie de ses ovocytes matures avec le sperme de son conjoint lui est permise. Afin d’éviter tout risque d’échec de fécondation, le processus d’insémination des ovocytes est généralement l’ICSI (IntraCytoplasmic Sperm Injection), consistant à déposer à l’aide de micropipettes appropriées un spermatozoïde vivant dans le cytoplasme de chaque ovocyte au stade métaphase 2. Le lendemain, le rapport du nombre d’ovocytes fécondés (zygotes ou 2PN) par le nombre d’ovocytes « injectés » déterminera le taux de fécondation. Ce taux de fécondation est en moyenne >60%. Les zygotes pourront être ensuite cultivés dans des conditions strictement contrôlés au laboratoire jusqu’à différents stades dits précoces (Jours 2 et/ou 3 : embryon stade 4 et 8 cellules, respectivement) ou tardifs (Jours 5 et/ou 6 : embryon stade blastocyste).
Qualité des Ovocytes
La qualité intrinsèque des ovocytes joue un rôle crucial dans leur capacité à survivre aux procédures de congélation et de décongélation. Les ovocytes de mauvaise qualité sont plus susceptibles de subir une lyse. Chez la femme, la réserve d’ovules dans les ovaires diminue avec l’âge. La femme nait avec un certain nombre d’ovocytes qui disparaissent progressivement.
Prévention de la Lyse Ovocytaire
Plusieurs stratégies peuvent être mises en œuvre pour minimiser le risque de lyse ovocytaire :
- Optimisation des techniques de cryoconservation: Utilisation de protocoles de vitrification optimisés et adaptés à la sensibilité des ovocytes. La vitrification embryonnaire, enfin autorisée en France, est un réel progrès dans nos centres d’AMP. En effet, la littérature démontre une nette amélioration de la survie des embryons congelés par cette méthode lorsque comparée à la CL. Ainsi, les embryons congelés sont disponibles à un taux nettement plus élevé qu’après CL pour un transfert intra utérin ultérieur, compte tenu d’une survie approchant les 100%.
- Formation du personnel: Formation adéquate du personnel de laboratoire aux techniques de manipulation des ovocytes et de cryoconservation.
- Sélection des ovocytes: Sélection rigoureuse des ovocytes de bonne qualité pour la cryoconservation.
- Réduction des manipulations: Minimisation des manipulations physiques des ovocytes lors de l'ICSI et d'autres procédures.
Implications et Perspectives
La lyse ovocytaire peut avoir des implications importantes pour les couples ou les femmes célibataires qui ont recours à la PMA. Elle peut réduire le nombre d'ovocytes disponibles pour la fécondation, diminuer les chances de succès de la PMA et entraîner des coûts supplémentaires.
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La vitrification ovocytaire est assurément un progrès qui révolutionnera nos pratiques, tout en posant de nombreuses questions. Sa supériorité, comparée à la CL, a été démontrée pour le système ouvert même si cette démonstration manque encore de puissance et là aussi, sans risque surajouté pour les enfants nés après congélation ovocytaire (Wennerholm et al., 2009). L’efficacité de la vitrification ovocytaire utilisant un système fermé reste à évaluer sur des séries plus importantes.
Il est très important de rappeler aux couples pris en charge pour préservation de la fertilité la réglementation en vigueur concernant la filiation des gamètes ou embryons, afin qu’ils se déterminent en conscience sur les conséquences possibles de leur choix. Les ovocytes vitrifiés appartiennent à la femme qui pourra donc en disposer si besoin lorsque guérie de sa maladie. Les embryons, quant à eux, appartiennent aux couples et non à la femme seule.
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