Introduction
L'ovocyte de souris est un modèle d'étude crucial pour comprendre les mécanismes fondamentaux de la régulation du cycle cellulaire, en particulier le déclenchement de la phase M (mitose ou méiose). Cet article explore en détail les différentes phases du cycle cellulaire, les mécanismes de régulation et de surveillance, ainsi que le rôle clé de l'ovocyte dans la découverte du Maturation Promoting Factor (MPF) et des kinases cycline-dépendantes (Cdk).
Les Phases du Cycle Cellulaire
Le cycle cellulaire est un processus ordonné et immuable, divisé en quatre phases principales : G1, S, G2 et M. Les phases G1, S et G2 constituent l'interphase, une période durant laquelle le noyau cellulaire est délimité par une enveloppe nucléaire. La mitose (M), quant à elle, est marquée par la disparition de cette enveloppe et l'apparition des chromosomes, qui deviennent visibles au microscope photonique en raison de leur compaction.
Régulation du Cycle Cellulaire
Pour garantir le déroulement correct du cycle cellulaire et l'obtention de deux cellules filles identiques, la cellule dispose de systèmes de régulation perfectionnés. Ces systèmes assurent à la fois l'ordre immuable de la succession des phases et la surveillance de l'ADN.
La régulation du cycle est principalement assurée par les kinases cycline-dépendantes (Cdk). Ces enzymes interviennent à différents moments du cycle :
- Phase G1 et transition G1-S : Déclenchement de la réplication de l'ADN.
- Phase S : Poursuite de la réplication.
- Phase G2 et transition G2-M : Déclenchement et exécution de la mitose.
Surveillance de l'ADN
Les mécanismes de surveillance s'ajoutent à la régulation par les Cdk, assurant le maintien de l'intégrité de l'ADN et la qualité de la réplication. Les dérèglements du cycle cellulaire peuvent conduire à des proliférations anarchiques, comme dans le cas des cancers.
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L'Ovocyte : Un Système Modèle
L'ovocyte a joué un rôle essentiel dans l'analyse du déclenchement de la phase M. L'injection de cytoplasme prélevé dans un ovocyte II maturé (bloqué en métaphase II) dans un ovocyte I induit l'entrée en méiose de ce dernier. Cette expérience a révélé l'existence d'une substance contenue dans le cytoplasme de l'ovocyte bloqué en métaphase II, capable d'induire la maturation. Ce facteur a été nommé MPF (Maturation Promoting Factor).
Il a été découvert par la suite que le MPF n'est pas seulement un déclencheur de la méiose ovocytaire, mais qu'il déclenche également l'entrée en mitose (phase M) des cellules somatiques. En réalité, le cytoplasme injecté contient du MPF "actif", ce qui explique le blocage de l'ovocyte en métaphase II.
Fusion Cellulaire
La fusion de deux cellules à des stades différents du cycle cellulaire permet de créer un hétérocaryon, une cellule contenant deux noyaux différents avec mise en commun des cytoplasmes. La fusion d'une cellule en mitose avec une cellule en interphase induit la condensation des chromosomes de la cellule en interphase. Ce phénomène démontre qu'un facteur présent dans la cellule en mitose peut induire une "entrée en mitose" précoce du noyau de la cellule en interphase. Un facteur diffusible présent dans la cellule en phase M induit l'entrée en mitose (condensation des chromosomes et disparition de l'enveloppe nucléaire) de la cellule en phase G2.
Identification et Caractérisation du MPF et des Cdk
Mis en évidence en 1971, le MPF n'a été identifié et caractérisé précisément qu'en 1988. Il s'agit d'un complexe cycline/Cdk qui agit en déclenchant différentes réactions. Les kinases cycline-dépendantes et autres protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire des cellules de mammifères ont été identifiées grâce aux études effectuées sur la levure (Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe) par une recherche systématique des mutations dans les gènes codant pour des molécules intervenant dans le cycle cellulaire, cdc (cell division cycle). Des souches de mutants cdc thermosensibles ont été utilisées. Toutes les protéines identifiées chez la levure sont des protéines qui ont été conservées au cours de l'évolution et elles existent également chez les mammifères.
Réplication Prématurée
La fusion d'une cellule en phase S avec une cellule en phase G1 ou G2 donne des résultats différents. Si la cellule est en G1, on observe, après fusion, une réplication prématurée des fibres chromatiniennes de G1. Un facteur présent en phase S permet l'entrée en phase S des cellules n'ayant pas encore répliqué leur ADN (cellules en phase G1).
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Le Régulateur Universel de l'Entrée en Mitose
Entre 1987 et 1990, le régulateur universel de l'entrée en mitose (le MPF) a été caractérisé : il s'agit d'une kinase cycline-dépendante (Cdk) associée à une cycline. Entre 1990 et 2000, une douzaine de Cycline / Cdk ont été décrites chez l'homme. Six d'entre elles interviennent dans le contrôle direct du déroulement du cycle cellulaire.
Les Cyclines et les Cdk
Les cyclines ne sont pas présentes pendant tout le cycle, elles apparaissent puis disparaissent brusquement à des moments précis du cycle, de façon périodique. Les Cdk peuvent donc être sous forme activée ou désactivée, selon qu'elles sont associées ou non à leur cycline. Les Cdk sont des sérine-thréonine kinases, enzymes qui catalysent la phosphorylation de protéines cibles (= substrats) jouant un rôle dans les événements du cycle cellulaire (fragmentation de l'enveloppe nucléaire, compaction des chromosomes, réplication de l'ADN…), ou dans l'avancement du cycle.
Le cycle cellulaire est contrôlé par au moins 6 complexes Cycline / Cdk différents qui interviennent à des moments précis du cycle cellulaire. Responsable de la transition G1/S. Les Cdk sont présentes avant qu'elles ne soient requises. C'est, premièrement, grâce aux cyclines, qui n'ont pas d'activité enzymatique par elles-mêmes, mais se lient aux kinases du cycle pour les rendre actives. C'est, deuxièmement, grâce à des protéines déphosphorylant (Cdc 25) ou phosphorylant (CAK, Wee-1) les Cdk et qui permettent de compléter le contrôle de l'activité des Cdk. D'autre part des acides aminés jouent un rôle particulier suivant qu'ils sont phosphorylés ou non.
Activation et Inactivation des Cdk
Pour pouvoir agir, les Cdk doivent présenter une conformation où deux poches sont accessibles. Avant la liaison de la Cdk à la Cycline, le site catalytique de la Cdk est inaccessible pour l'ATP : les boucles PSTAIRE (noms des acides aminés) et T-loop ferment l'entrée du site. La CAK phosphoryle la Thréonine 161 qui se situe au sommet de la boucle T et qui est devenue accessible après la liaison de la cycline à la Cdk. Ceci a pour effet un changement de conformation qui dégage l'entrée du site substrat et permet la fixation du substrat sur la Cdk.
Wee1 phosphoryle la Cdk sur la Thréonine 14 et la Tyrosine 15. Ces phosphorylations provoquent une répulsion électrostatique qui interdit l'entrée de l'ATP dans son site, elles sont donc inhibitrices. Dans ce cas, même si la Cdk est phosphorylée sur Th 161 par la CAK (elle accepte alors le substrat), elle reste inactive car l'ATP ne peut pas prendre sa place. C'est la raison pour laquelle les phosphorylations inhibitrices dominent la phosphorylation activatrice. Quand la p21 se lie à la cycline, elle bloque la poche de l'ATP.
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L'activité des complexes Cycline / Cdk peut être inhibée par la phosphorylation de 2 acides aminés (tyrosine 15 et thréonine 14) : la phosphorylation de ces acides aminés se fait par les kinases Wee-1 et Myt 1.
Mécanismes de Surveillance du Cycle Cellulaire
En plus des Cdk, molécules permettant le passage d'une phase à l'autre et l'enchaînement des événements du cycle, existent des mécanismes capables de surveiller des processus très importants du cycle, de détecter des anomalies et d'imposer l'arrêt du cycle si des anomalies sont constatées. Ces mécanismes interviennent lorsque des lésions (DDCP = DNA Damage Checkpoint) ou des anomalies de réplication de l'ADN (RCP = Réplication Checkpoint) sont détectées, ou pour contrôler que les chromatides-sœurs vont bien se répartir équitablement dans les deux cellules filles (MCP = Mitotic Checkpoint).
En effet, cette surveillance assure le maintien de l'intégrité de l'ADN et la qualité de la réplication de l'ADN. Si l'ADN présente des lésions ou si la réplication ne s'effectue pas correctement, le cycle est arrêté pour donner à la cellule le temps de réparer et de terminer correctement la réplication. Un autre aspect du contrôle veille à ce que le partage des chromosomes entre les 2 cellules-filles s'effectue de façon parfaitement équitable au cours de la transition métaphase - anaphase : si tous les chromosomes ne sont pas correctement attachés aux fibres kinétochoriennes, l'anaphase ne débute pas, les deux chromatides-sœurs de chaque chromosome restent liées l'une à l'autre.
Les Différents Points de Contrôle
- Surveillance de l'intégrité de l'ADN (DDPC) : Cette surveillance n'est pas réalisée en un point particulier du cycle mais s'effectue en réalité tout au long de l'interphase (G1, S, G2). Ainsi, lorsqu'une lésion de l'ADN existe, le cycle peut être arrêté soit en G1, (la cellule n'effectue alors pas la transition G1/S), soit en S, soit en G2 (la cellule ne rentre alors pas en mitose).
- Surveillance de l'accomplissement de la réplication (RCP) : Cette surveillance ne se fait pas en un point précis du cycle mais s'étale tout au long de la phase S et de la phase G2. Ainsi, la cellule ne pourra pas commencer la mitose tant que la réplication n'est pas correctement terminée et lorsqu'un défaut de réplication est détecté, la cellule arrête le cycle.
- Surveillance de l'attachement correct des chromosomes métaphasiques au fuseau, ou checkpoint mitotique (MCP) : Cette surveillance ne s'exerce que dans le court laps de temps de la métaphase et jusqu'à ce que le dernier chromosome ait atteint la plaque métaphasique.
Molécules Impliquées dans la Surveillance
Parmi ces molécules se trouvent des kinases qui se lient à l'ADN, (DNA-PK) : kinase ATM (ataxia-telangiectasia mutée), kinase ATR (ataxia-telangiectasia Related), ainsi que les protéines sérine-thréonine kinases Chk1 et Chk2 (check-point protein kinase). Chez les patients atteints d'ataxia-telangiectasia mutated, la kinase ATM est mutée et les points de contrôle du cycle sont déficients : les cellules continuent à proliférer malgré la présence de coupures dans l'ADN; elles ne s'arrêtent pas en G1, S ou en G2 pour réparer l'ADN.
Blocage de la Transition G1-S
Si l'ADN est endommagé, la transition G1-S est bloquée par les mécanismes de surveillance de l'état de l'ADN (DDCP). Ces mécanismes aboutissent d'une part à la dégradation de Cdc25A, ce qui arrête le cycle puisque les complexes Cycline D / Cdk4 et Cyclines E, A / Cdk2 ne peuvent plus être activés par Cdc 25A, d'autre part à l'accumulation dans la cellule de p53 qui induit l'expression de p21, inhibiteur des complexes Cyclines E, A / Cdk2.
Maintien de l'Arrêt en G2
Dans ce cas, il s'agit pour la cellule de faire en sorte que la mitose ne soit pas déclenchée tant que la réplication n'est pas totalement achevée ou tant que les lésions détectées dans l'ADN qui s'est répliqué ne sont pas réparées. Le maintien de l'arrêt en G2 fait intervenir également la p53, facteur de transcription de la p21 et d'enzymes de réparation de l'ADN. Si l'ADN est lésé, ou si la réplication n'est pas achevée, l'activation de plusieurs voies inhibitrices du complexe Cdk 1 / Cycline B permet d'empêcher l'entrée en mitose.
Surveillance de l'Attachement des Chromosomes au Fuseau Mitotique
L'attachement correct des chromosomes au fuseau mitotique en plaque métaphasique est indispensable au déclenchement de l'anaphase. Un mécanisme opère pour s'assurer que tous les chromosomes sont correctement attachés au fuseau avant que la séparation des chromatides-sœurs n'ait lieu. Normalement, à l'anaphase, les chromatides-sœurs se séparent lorsque la séparase (une protéase) détruit par protéolyse spécifique la cohésine qui les maintient rassemblées. Or, tant que les chromosomes métaphasiques ne sont pas correctement attachés au fuseau par leurs kinétochores (et, il suffit qu'un seul ne le soit pas), la séparase est inhibée par la sécurine. Chaque kinétochore non correctement attaché au fuseau envoie un signal inhibiteur bloquant l'activation de APC-Cdc20. Ce signal généré par le kinétochore non attaché correspond à la protéine Mad2 : un seul kinétochore mal attaché a pour conséquence la liaison de Mad2 sur le complexe APC-Cdc20, et ainsi son inhibition.
La Transition G2/M et l'Activation du Complexe Cycline B/Cdk1
L'entrée en mitose, ou transition G2 / M, est sous le contrôle du complexe Cycline B / Cdk1, et se réalise de manière brutale. Le graphique présente la succession des complexes, et leur taux, en fonction des phases du cycle. La Cycline B s'accumule progressivement pendant les phases S et G2, ce qui conduit à une accumulation graduelle du complexe au fur et à mesure que la cellule approche de la mitose. La Cdk1 est alors phosphorylée sur la thréonine 161 par la CAK (Cycline H / Cdk7), mais reste inactive à cause de la phosphorylation de 2 acides aminés voisins (tyrosine 15 et thréonine 14) par la protéine Wee-1. Ainsi, quand la cellule atteint la fin de la phase G2, elle contient un abondant stock de Cycline B / Cdk1 ( stock de pré-MPF inactif) prêt à agir mais dont l'activité est réprimée par la présence de 2 groupes phosphate qui bloquent la kinase.
Activation de Cdc25
Lorsque la réplication est terminée, la phosphatase Cdc25 n'est plus séquestrée dans le cytoplasme et passe dans le noyau, et en fin de phase G2, la phosphatase Cdc 25 est activée, probablement par phosphorylation par la kinase Polo. Cdc 25 a alors pour action d'enlever les deux phosphates inhibiteurs de Cycline B / Cdk 1. Cdk 1 peut alors phosphoryler Cdc 25 (sur un site différent de celui de la kinase Polo). Cette phosphorylation active Cdc 25 : Cycline B / Cdk 1 active donc son propre activateur (processus d'auto-activation). Selon ce mécanisme, une activation partielle de Cdc 25 par la kinase Polo permet l'activation d'une sous population de complexes Cycline B / Cdk 1 qui, par la suite, phosphoryle plus de Cdc-25 et de Wee-1. Les complexes Cycline B / Cdk 1, une fois activés, permettent l'entrée en mitose.
Rôle du Complexe Cycline B/Cdk1 dans la Mitose
Au début de la mitose, les complexes Cycline B / Cdk1 activés agissent en phosphorylant diverses protéines cibles. La phosphorylation des lamines (filaments intermédiaires du noyau) par la Cycline B / Cdk 1, au début de la mitose, provoque leur dépolymérisation. Or ces lamines étaient associées à l'enveloppe nucléaire et permettaient de la structurer. En conséquence, leur dépolymérisation a pour effet de désorganiser l'enveloppe nucléaire qui se disperse en petites vésicules. Certaines lamines (les lamines B) restent ancrées dans les vésicules d'enveloppe nucléaire, car elles sont isoprénylées (ancre lipidique). Les lamines ont des séquences de liaison aux chromosomes, ce qui facilite la reformation de l'enveloppe nucléaire autour de ceux-ci en fin de mitose.
L'activation massive et irréversible du complexe Cycline B / Cdk1 permet l'entrée en mitose.
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