Introduction
Comprendre les mécanismes qui régulent le positionnement du noyau et décrypter les informations que ce positionnement véhicule constitue un axe de recherche majeur en biologie de la reproduction et du développement. En effet, chez la plupart des espèces, la position du noyau à la fin de la croissance de l'ovocyte prédéfinit les axes du futur embryon. Ainsi, chez le nématode, l'oursin, le xénope et le poisson-zèbre, le noyau de l'ovocyte marque le pôle animal, qui instruira les futurs axes de l'embryon, et chez la drosophile, il définit le futur axe dorso-ventral de l'embryon. Cependant, ce n'est pas le cas chez les mammifères où le noyau se trouve parfaitement centré à la fin de la croissance de l'ovocyte dans l'ovaire. Ce centrage du noyau est d'autant plus surprenant que les ovocytes effectuent ensuite deux divisions extrêmement asymétriques, avec un décentrage de leurs chromosomes. Plus surprenant encore, dans l'ovocyte de souris et d'humain, il existe même une corrélation entre le centrage du noyau et le succès des divisions méiotiques.
L'ovocyte est un système modèle qui a permis d'analyser le déclenchement de la phase M du cycle cellulaire. L'injection de cytoplasme prélevé dans un ovocyte II maturé (bloqué en métaphase II) dans un ovocyte I, induit l'entrée en méiose de ce dernier. Cette expérience montre qu'une substance contenue dans le cytoplasme de l'ovocyte bloqué en métaphase II peut induire la maturation. Ce facteur a été appelé MPF (Maturation Promoting Factor). On s'aperçut par la suite que le MPF n'est pas seulement le déclencheur de la méiose ovocytaire, mais qu'il déclenche aussi l'entrée en mitose (phase M) des cellules somatiques.
Le travail de Maria Almonacid, sous la supervision de Marie-Hélène Verlhac au CIRB, Collège de France, a cherché à mieux comprendre ce lien inattendu entre le centrage du noyau et le succès de la méiose dans l'ovocyte de mammifère.
Centrage du noyau de l'ovocyte via un gradient de pression dépendant de l'actine
L'ovocyte de souris, une grande cellule sphérique de 80 μm, ne possède pas les caractéristiques (centrosomes et microtubules associés, cortex différencié) qui permettent normalement la polarisation, la définition de son centre géométrique et le positionnement du noyau. Cependant, il parvient à parfaitement centrer son noyau, dont la taille est comparable à celle d'une cellule somatique (30 μm). Lors de travaux antérieurs, Maria Almonacid et Marie-Hélène Verlhac, en collaboration avec les bio-physiciens Timo Betz (Institut Curie, Paris) et les théoriciens Raphaël Voituriez (SU, Paris) et Nir Gov (Weizmann Institute, Tel Aviv), ont découvert un nouveau mode très original de centrage du noyau de l'ovocyte, qui dépend uniquement du cytosquelette d'actine et non des microtubules, contrairement à de nombreux autres types de cellules.
Les ovocytes invalidés pour le nucléateur d'actine Formine 2 (Fmn2−∕−), un gène maternel essentiel, présentent des noyaux décentrés. La réintroduction de Formine 2 permet la formation d'un réseau d'actine dans le cytoplasme et provoque le centrage du noyau, de manière extrêmement robuste : tous les ovocytes ont leur noyau centré en 6 heures. Ce centrage dépend du moteur moléculaire d'actine, la Myosine Vb, qui génère la dynamique du maillage d'actine. Le rôle de la Myosine Vb est double : elle crée un gradient dans l'activité du maillage d'actine, qui diminue du cortex vers le centre, analogue à un gradient de pression qui génère une force qui pousse de manière non spécifique le noyau vers le centre ; elle fluidifie également le cytoplasme par advection, créant un mouvement global de tous les organels cytoplasmiques, donc un environnement qui est approprié pour le mouvement de grands objets tels que le noyau.
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Ce mécanisme détecte principalement la taille des objets. Ainsi, tout objet suffisamment grand peut être transporté sur de longues distances, ce qui est très bénéfique dans le cas de grandes cellules telles que les ovocytes.
La robustesse de ce nouveau mécanisme de centrage du noyau a conduit Maria Almonacid et Marie-Hélène Verlhac à interroger son rôle physiologique dans des aspects de leur travail orientés vers la biologie de la reproduction et du développement.
Impact du réseau cytoplasmique d'actine nucléé par la Formine 2 sur la position et l'architecture du noyau
Les ovocytes invalidés pour la Formine 2 ont des noyaux décentrés et présentent également des noyaux déformés par rapport aux noyaux témoins. Ils présentent systématiquement une invagination et leur chromatine apparaît moins condensée. Ces défauts combinés tendent à augmenter les contacts entre l'enveloppe nucléaire et la chromatine, contacts qui sont généralement rares dans les ovocytes en fin de croissance.
En collaboration avec Auguste Genovesio (IBENS, ENS, Paris), une approche de biologie computationnelle a été développée pour reconstruire les noyaux à partir d'images acquises en 3D. Cette approche a permis d'identifier, de manière non biaisée, les paramètres permettant de décrire quantitativement l'architecture des noyaux d'ovocytes et ainsi de distinguer différentes catégories de noyaux sur la seule base de ces paramètres. De cette manière, les variations de l'architecture nucléaire entre différentes conditions (témoins, Fmn2−∕−, Fmn2−∕− dans lesquels la Formine 2 entière ou son domaine de nucléation d'actine FH1FH2 a été réintroduit), ont pu être quantifiées avec précision.
Ainsi, la réintroduction de Formine 2 permet d'induire le centrage du noyau et de restaurer complètement la forme et l'architecture nucléaires. La réintroduction du seul domaine de nucléation d'actine de Formine 2 restaure une grande partie de cette architecture, ce qui montre que le maillage cytoplasmique d'actine a une contribution majeure dans le maintien de la forme et de l'architecture du noyau de l'ovocyte.
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Fluctuations de l'enveloppe nucléaire générées par le réseau cytoplasmique d'actine
Les chercheurs ont ensuite examiné les noyaux à haute résolution temporelle en utilisant la vidéo-microscopie d'une sonde nucléaire et ont observé la nature hautement dynamique de l'enveloppe nucléaire, qui est soumise à de grandes fluctuations en amplitude et en fréquence.
Par ce moyen, ils ont confirmé les défauts d'architecture nucléaire observés dans l'approche 3D précédemment décrite sur des ovocytes fixés : les noyaux témoins adoptent une forme régulière tandis que les noyaux Fmn2−∕− ou d'ovocytes traités avec un médicament dépolymérisant l'actine sont asymétriques, principalement lisses et inactifs sur 2/3 de leur surface, et présentant une invagination où des fluctuations locales se produisent, correspondant au 1/3 restant.
Ils ont également clarifié le rôle des microtubules dans la dynamique du noyau : ils aident à stabiliser l'enveloppe nucléaire. En leur absence (traitement avec un médicament induisant la dépolymérisation des microtubules), les fluctuations de l'enveloppe sont amplifiées.
Ils ont également déterminé l'origine de l'invagination observée dans les noyaux d'ovocytes dépourvus de réseau cytoplasmique d'actine (Fmn2−∕− ou traités avec un médicament). Il correspond à la présence d'un centre majeur d'organisation des microtubules (MTOC) à partir duquel les microtubules contactent et déforment localement l'enveloppe.
Finalement, ils ont quantifié et effectué une analyse de fréquence des fluctuations de l'enveloppe nucléaire, ce qui a permis d'établir un modèle des propriétés mécaniques de l'enveloppe nucléaire, toujours en collaboration avec Raphaël Voituriez (SU, Paris). Il a permis de vérifier que les différences dans l'étendue des fluctuations entre les noyaux des témoins, Fmn2−∕− et des témoins traités avec un médicament dépolymérisant l'actine, proviennent bien des forces cytoplasmiques et de la dynamique du réseau d'actine. Ces différences ne sont pas dues à des différences intrinsèques dans les propriétés mécaniques de l'enveloppe.
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Transmission des fluctuations de l'enveloppe nucléaire à l'intérieur du noyau et mise en mouvement de la chromatine
Afin d'étudier l'impact des fluctuations de l'enveloppe nucléaire à l'intérieur du noyau, le mouvement de la chromatine a été surveillé par vidéo-microscopie à la même résolution temporelle que celle déterminée pour l'étude des fluctuations de l'enveloppe nucléaire.
Une réduction significative de l'amplitude du mouvement de la chromatine a été observée dans les ovocytes dépourvus de réseau cytoplasmique d'actine (Fmn2−∕− ou traitement avec un médicament). Les expériences FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), permettant de mesurer la diffusion de protéines fluorescentes, sur la sonde nucléaire, qui diffuse indépendamment de la chromatine, ont permis d'exclure une différence potentielle de viscosité à l'intérieur des noyaux témoins et Fmn2−∕−. Ceci suggère que la différence de dynamique de la chromatine dépend strictement de l'amplitude des fluctuations de l'enveloppe nucléaire. De plus, une corrélation entre la proximité de la chromatine à l'enveloppe nucléaire et la quantité de mouvement a pu être établie.
Ainsi, les fluctuations de l'enveloppe nucléaire sont transmises à l'intérieur du noyau, bien qu'avec une dissipation d'énergie, et affectent la dynamique des objets à l'intérieur du noyau, tels que la chromatine.
Modulation de l'expression des gènes par les fluctuations de l'enveloppe nucléaire générées par l'actine cytoplasmique
Afin de déterminer si cette dynamique différentielle de la chromatine a des conséquences sur l'expression des gènes, les chercheurs ont effectué un séquençage comparatif de l'ARN (RNA seq) entre des ovocytes témoins et Fmn2−∕−. Cette étude transcriptomique a révélé 256 gènes différentiellement exprimés dans Fmn2−∕− (244 sous-exprimés et 12 surexprimés).
La plupart d'entre eux correspondent à des gènes codant des protéines et une analyse approfondie de leurs localisations chromosomiques a révélé qu'ils étaient répartis uniformément dans le génome, ce qui est cohérent avec un effet global des fluctuations de l'enveloppe impactant le génome de toutes les directions.
Afin de vérifier si ces gènes étaient effectivement sensibles au centrage du noyau, le niveau d'expression des gènes les plus significativement dérégulés a été analysé dans des ovocytes dont le noyau a été recentré. Cela a montré que la réintroduction de Formine 2 dans les ovocytes Fmn2−∕− restaure partiellement les niveaux d'expression de quelques gènes qui ont été testés.
Les progrès récents dans la compréhension de l'organisation nucléaire ont montré que la chromatine peut être active ou réprimée selon qu'elle se localise dans des compartiments dits A ou B et qu'elle est associée ou non aux lamines à l'enveloppe nucléaire interne. La chromatine dans les compartiments A est plus ouverte et active que dans B, où elle est plus fermée et contient des marques réprimées. Les domaines associés aux lamines (LAD) sont généralement silencieux transcriptionnellement et la chromatine est enrichie en marques réprimées. Une analyse croisée de la liste des gènes dérégulés avec les données des LAD et des compartiments dans les cellules ES montre une localisation préférentielle de ces gènes dans les domaines actifs de la chromatine (interLAD constitutifs, qui sont des régions jamais associées aux lamines dans un panel de différents types de cellules et les compartiments A). Ceci est cohérent avec une récupération partielle des niveaux d'expression des gènes dépendant de l'activité transcriptionnelle, car cela n'a pas été observé en présence d'inhibiteurs de la transcription. Ces résultats ont également conduit à reconsidérer le dogme d'un arrêt total de l'activité transcriptionnelle à la fin de la croissance de l'ovocyte, complémentaire aux découvertes dans les ovocytes de drosophile. En effet, nous fournissons des preuves de loci transcriptionnels persistants dont l'activité dépend de la présence du maillage d'actine dans les ovocytes de souris pleinement développés.
Finalement, l'absence de filaments d'actine dans le noyau et les niveaux comparables d'actine monomérique dans les noyaux des témoins et Fmn2−∕− permettent d'exclure une contribution de l'actine nucléaire dans ces processus.
Pris ensemble, ces résultats plaident en faveur d'un mécanisme entièrement nouveau de régulation des gènes par mécano-transduction, piloté par la dynamique du réseau cytoplasmique d'actine impactant la chromatine et l'expression des gènes à l'intérieur du noyau à travers les fluctuations de l'enveloppe nucléaire.
Conclusion
Ce travail collaboratif entre biologistes, bio-physiciens théoriciens et statisticiens a permis de mieux comprendre le lien entre le centrage du noyau et le succès des divisions méiotiques. Le même phénomène physique qui centre le noyau de l'ovocyte génère un type unique de processus de mécano-transduction dans lequel la dynamique du réseau d'actine dans le cytoplasme agite le noyau en "massant" activement sa surface. Ce processus permet la transmission de forces du cytoplasme à l'intérieur du noyau, contrôlant la transcription d'un certain ensemble de gènes.
Les divisions méiotiques ainsi que les premiers stades du développement embryonnaire se produisent à de très faibles niveaux transcriptionnels, d'où le succès des premiers stades du développement embryonnaire dépend strictement de la quantité d'ARNm maternels accumulés dans l'ovocyte. Cette quantité est impactée en l'absence du processus de mécano-transduction provenant du cytoplasme. Ainsi, en modulant finement les stocks d'ARNm maternels, le centrage du noyau est prédictif de la qualité du gamète femelle et de son potentiel de développement après la fécondation.
Intercinèse et Formation de l'Enveloppe Nucléaire
La division cellulaire est un processus essentiel pour le développement, l'homéostasie et la reproduction des organismes. Chez les eucaryotes, la sortie d'interphase et l'entrée en division cellulaire sont marquées par la rupture de l'enveloppe nucléaire et la condensation des chromosomes. Puis, en fin de division, la cellule entre à nouveau en interphase et l'enveloppe nucléaire se reforme autour des chromosomes en cours de décondensation.
La reproduction des organismes nécessite la production de gamètes haploïdes (ovocytes et spermatozoïdes) au cours d'une division spécialisée appelée méiose. La méiose correspond à deux étapes de ségrégation des chromosomes séparées par un court intervalle, nommé intercinèse. Dans les ovocytes en intercinèse, les chromosomes restent condensés. Il a donc été proposé que l'intercinèse ne correspond pas à une réelle interphase et que, par conséquent, l'enveloppe nucléaire ne se reforme pas à ce stade.
Cependant, un travail de thèse dans les ovocytes de Caenorhabditis elegans a conduit à identifier une double membrane entourant la surface des chromosomes condensés en intercinèse. En combinant des approches de vidéo-microscopie et de microscopie électronique, il a été démontré que l'enveloppe d'intercinèse est une structure transitoire présente entre l'anaphase I et l'entrée en méiose II. L'enveloppe d'intercinèse est composée de la lamine LMN-1 et de protéines de la membrane interne LEM-2, SUN-1 et EMR-1. Cependant, elle est dépourvue des protéines de la membrane externe ZYG-12 et SP-12, ce qui est cohérent avec l'absence de continuité entre l'enveloppe d'intercinèse et le réticulum endoplasmique. Par ailleurs, et de manière surprenante, bien que cette enveloppe soit dépourvue de pores nucléaires, certaines nucléoporines y sont présentes. Par l'analyse de la fonction des composants de l'enveloppe d'intercinèse, il a été démontré que la formation de celle-ci dépend de la nucléoporine MEL-28ELYS, qui recrute des membranes sur les chromosomes en cours de ségrégation, et du « facteur barrière à l'auto-intégration » BAF-1Banf1 assurant l'intégrité de l'enveloppe. Enfin, les résultats démontrent que l'enveloppe d'intercinèse n'est jamais totalement scellée, et ne dépend donc pas du complexe ESCRTIII normalement nécessaire à la fermeture de l'enveloppe nucléaire en interphase.
Finalement, l'étude fonctionnelle de l'enveloppe d'intercinèse suggère qu'elle participe à la ségrégation correcte des chromosomes dans l'ovocyte de C. elegans. En effet, il a été démontré qu'en son absence, les chromosomes se séparent plus rapidement, et sur une plus grande distance, que dans les ovocytes contrôles. Dans l'ensemble, ce travail démontre que l'enveloppe d'intercinèse est une nouvelle organelle qui entoure les chromosomes condensés et participe à leur ségrégation correcte dans l'ovocyte de C.
Régulation du cycle cellulaire et enveloppe nucléaire
Dans un cycle, les quatre phases se succèdent dans un ordre immuable : G1, S, G2 et M. Les trois premières phases (G1, S, G2) constituent l’interphase, durant laquelle le noyau de la cellule est limité par une enveloppe nucléaire, alors que la mitose (M) est caractérisée par la disparition de cette enveloppe et par l’apparition des chromosomes. Ces derniers deviennent alors visibles au microscope photonique parce qu’ils se compactent. Pour assurer, d’une part, l’ordre immuable de la succession des quatre phases du cycle (régulation du cycle), et d’autre part, l’obtention de deux cellules filles rigoureusement identiques (surveillance de l’ADN), la cellule dispose de systèmes de régulation hautement perfectionnés. Les dérèglements du cycle cellulaire conduisent à des proliférations anarchiques.
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