Introduction
La micro-injection d'ovocytes bovins est une technique de pointe relevant de l'embryologie spéciale et expérimentale. Elle s'inscrit dans un ensemble de manipulations des gamètes et des embryons visant à améliorer la production animale, notamment par l'insémination artificielle et le transfert d'embryons. Cette technique, comme d'autres telles que la congélation de sperme et d'embryons, la bissection et le sexage des embryons, contribue à la sélection génétique et à l'augmentation de la productivité des animaux domestiques.
Contexte et Évolution des Techniques de Reproduction Assistée
L'histoire de l'Assistance Médicale à la Procréation (AMP) est intimement liée aux avancées de la cryobiologie. Des étapes clés incluent la congélation de sperme en 1946, le développement de la fécondation in vitro (FIV) entre 1978 et 1982, la première naissance après congélation d'embryon en 1984, la première naissance après congélation d'ovocytes en 1986, l'ICSI (injection intra-cytoplasmique d'un seul spermatozoïde) en 1992, et la vitrification de l'ovocyte en 1999, suivie de la congélation de cortex ovarien en 2004.
Un tournant majeur fut l'avènement du clonage en 1997 avec la naissance de Dolly, la brebis clonée. Dolly a marqué une rupture car elle est issue de la fusion d'un ovocyte énucléé et du noyau d'une cellule adulte. Auparavant, le clonage se limitait à la scission d'embryons précoces. Dolly a démontré qu'un noyau de cellule adulte pouvait être reprogrammé pour initier un cycle de divisions menant à un embryon viable.
Aujourd'hui, le clonage est appliqué à un nombre croissant d'espèces animales. La technique consiste à remplacer le matériel génétique d'un ovocyte par celui d'une cellule de l'animal à cloner. Initialement développée chez les amphibiens, elle a été étendue aux mammifères. Après Dolly, le clonage a été réussi chez la souris, la chèvre, la vache et le porc. Cependant, les animaux clonés présentent souvent des anomalies de développement fœtal et prénatal.
Principes Biologiques de la Micro-injection et du Clonage
Le développement embryonnaire précoce est d'abord contrôlé par des facteurs cytoplasmiques maternels, puis par l'expression des gènes de l'embryon. L'information génétique du noyau donneur, initialement spécialisée, est reprogrammée pour contrôler le développement du nouvel embryon. Les changements observés dans le noyau donneur indiquent qu'il réagit à son nouvel environnement cytoplasmique. Les caractéristiques du noyau donneur (type de cellule, stade du cycle cellulaire) influencent ces transformations.
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Les ovocytes, issus de la méiose, présentent un nombre de chromosomes réduit de moitié. La méiose se déroule dans la zone pellucide. Les ovocytes au stade de la deuxième métaphase sont les plus aptes au clonage par transfert de noyau. Ils proviennent d'ovaires d'animaux d'âges et d'origines variables, et peuvent être maturés in vivo ou in vitro. Les conditions de maturation sont mieux connues pour certaines espèces (vache, mouton) que pour d'autres (porc, chien).
L'énucléation consiste à micro-aspirer les chromosomes rassemblés en plaque métaphasique, ainsi que le globule polaire. L'activation induit des processus biochimiques similaires à ceux de la fécondation. Les oscillations de la concentration cytoplasmique en calcium diminuent l'activité du facteur mpf (Maturation Promoting Factor), qui bloque les ovocytes en métaphase II, permettant leur évolution vers un état interphasique favorable au développement. Le facteur mpf est un complexe protéique qui, une fois activé, entraîne la dissolution de l'enveloppe nucléaire et la condensation des chromosomes.
Techniques de Transfert de Noyau et d'Activation Ovocytaire
Dans la plupart des cas, le noyau donneur est transféré dans le cytoplasme receveur par fusion de la cellule donneuse avec l'ovocyte, obtenue par une brève impulsion électrique. Cette stimulation électrique contribue à l'activation de l'ovocyte receveur, surtout s'il est proche de l'interphase. Cependant, si l'ovocyte receveur est en métaphase II, ou que le noyau est injecté, les stimulations électriques peuvent être insuffisantes. On utilise alors des inhibiteurs de phosphorylation ou de la synthèse protéique après le transfert du noyau pour favoriser l'activation en évitant l'augmentation de l'activité du mpf.
Pour le clonage, des impulsions électriques déclenchent des flux intracellulaires de calcium qui participent au développement embryonnaire. Des composés chimiques inactivant le mpf peuvent également être utilisés, mais leur innocuité sur le développement ultérieur doit être démontrée.
Types de Cellules Donneuses et Leur Influence sur le Clonage
Les cellules donneuses peuvent être des cellules en culture ou prélevées sur un tissu vivant. Selon l'application, on utilise des fibroblastes fœtaux (cellules peu différenciées à l'origine du tissu conjonctif) ou des cellules de tissus adultes à différents stades de différenciation. Les tentatives de clonage à partir de cellules complètement différenciées ont été infructueuses chez la souris (cellules nerveuses et cellules de Sertoli). De même, chez la vache, l'utilisation de kératinocytes de l'épiderme comme cellules donneuses n'a pas permis d'obtenir de gestation à terme.
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Il est difficile de prouver qu'un animal cloné résulte de l'utilisation d'un type donné de cellule différenciée, car différents stades de différenciation cellulaire coexistent dans la plupart des tissus biologiques. Cependant, les cellules complètement différenciées de la granulosa (entourant les ovocytes dans les ovaires) sont facilement identifiables. Leur utilisation réussie dans des expériences de clonage chez la vache et la souris indique que les noyaux de cellules différenciées peuvent redevenir totipotents.
L'efficacité du clonage dépend peu de l'état de différenciation des cellules. Les cellules germinales ne sont pas plus favorables que les fibroblastes de la peau d'animaux adultes. Cette variabilité témoigne de la plasticité du noyau des cellules engagées dans une voie de différenciation, ouvrant la voie au clonage à partir de cellules de tissus abondants et accessibles comme la peau ou le sang. Cependant, si de nombreux animaux ont été obtenus à partir de fibroblastes, un seul bovin a été obtenu à partir d'un globule blanc.
La plupart des travaux utilisent des fibroblastes cultivés pendant plusieurs semaines et souvent stockés congelés après une dizaine de jours. Chez le bovin, l'âge du donneur ne semble pas influencer le développement des embryons obtenus. Des taureaux âgés de 17 et 21 ans ont été clonés avec succès. De plus, aucun animal produit par transfert de noyau et vivant actuellement ne présente de signe apparent de vieillissement, quel que soit le type de cellule dont il est issu. Les phénomènes d'érosion des télomères ne semblent pas accélérés chez les animaux clonés.
Synchronisation Cellulaire et Plöidie Nucléaire
Lorsqu'un noyau est transplanté dans un ovocyte, l'activité élevée du mpf entraîne la dissolution de la membrane nucléaire et la condensation des chromosomes. Au moment de l'activation de l'ovocyte, l'activité du mpf diminue, la membrane nucléaire se reforme et la synthèse d'ADN commence. Il est donc crucial d'utiliser des cellules donneuses diploïdes (chromosomes en paires) avec les cytoplasmes en «métaphase» pour éviter un nombre anormal de chromosomes dans l'embryon.
Le noyau peut être transplanté avant la réplication de l'ADN dans un cytoplasme en métaphase II, ou à n'importe quel moment de l'interphase dans un cytoplasme lui-même en interphase. La reprise du cycle cellulaire dans l'embryon est normalement suivie de l'expulsion du dernier globule polaire contenant un lot complet de chromosomes. Cette expulsion, aléatoire chez la plupart des espèces dans les conditions expérimentales, peut être évitée par incubation de l'embryon en présence de cytochalasine, qui inhibe la polymérisation des microfilaments pendant l'activation. Elle peut aussi être utilisée pour éliminer la moitié des chromosomes afin que le noyau résultant soit diploïde.
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Les premiers mammifères clonés à partir de cellules somatiques l'ont été avec des cellules quiescentes après une période de culture en milieu appauvri. L'ADN de ces cellules non divisées n'est pas dupliqué, assurant la diploïdie. Cependant, des expériences chez la souris avec des noyaux en métaphase, ou chez le bovin avec des noyaux non synchronisés, indiquent que cet état du noyau donneur n'est pas le seul compatible avec un développement à terme. L'état de la chromatine du noyau serait plus déterminant que la phase du cycle cellulaire.
Des noyaux de globules rouges d'amphibiens, dont l'ADN est empaqueté sous une forme inactive, sont activés après un remodelage dans des extraits d'œuf de crapaud et un traitement biochimique facilitant les échanges entre le noyau et son environnement. De même, le clonage somatique du porc a été réussi grâce à une méthode en deux étapes : le noyau est remodelé dans un ovocyte en métaphase, puis transféré dans un ovule fécondé énucléé après transformation.
Le perfectionnement du clonage repose sur la compréhension des remodelages de la chromatine et des chromosomes d'un noyau introduit dans un cytoplasme embryonnaire. L'activité du génome doit être reprogrammée pour fonctionner comme un génome embryonnaire.
Efficacité et Défis du Clonage
Selon les méthodes et les espèces, un à deux tiers des embryons clonés avec des cellules somatiques se développent jusqu'au stade blastula. Ce résultat est encourageant comparé aux proportions d'embryons issus de fécondation in vitro atteignant ce stade (environ 60 % chez la vache). Cependant, la seule preuve d'une reprogrammation complète reste le développement complet et normal d'un animal viable et fertile.
Malgré son utilisation croissante, le clonage reste peu efficace. Seul un à quatre pour cent des embryons reconstitués avec des noyaux de cellules somatiques se développent à terme. Cette mortalité précoce est souvent associée à des anomalies du placenta. De plus, la mortalité tardive, lors du dernier tiers de la gestation ou après la naissance, atteint parfois 50 %. La cause de cette surmortalité est inconnue, mais elle témoigne d'un manque de maîtrise de la reprise de l'activité génétique.
Ces échecs soulignent le manque de connaissances sur les mécanismes mis en jeu lors du clonage. Les animaux de ferme constituent de bons modèles expérimentaux pour l'analyse des anomalies du développement fœtal en raison de leur longue gestation (neuf mois chez la vache). Certaines anomalies du développement sont également observées chez les embryons issus de fécondation in vitro. Décrites sous le terme de «syndrome du gros veau», ces anomalies semblent résulter d'une expression anormale de certains gènes soumis à l'empreinte parentale, ou des conditions de cultures in vitro précédant le transfert de l'embryon.
Perspectives d'Avenir : Transgenèse et Applications Thérapeutiques
Une fois ces inconvénients surmontés, le clonage de jeunes animaux à partir de cellules en culture sera complété par l'insertion d'un gène dans le noyau de ces cellules avant de les utiliser pour le clonage. Les animaux ainsi génétiquement modifiés par transfert de noyau seront utiles pour la recherche ou pour l'obtention de protéines à usage thérapeutique.
La technique classique d'obtention d'animaux transgéniques est la micro-injection d'ADN dans le noyau des embryons au stade de cellule unique. Largement utilisée pour la production de molécules thérapeutiques, son efficacité est variable. La modification génétique de noyaux de cellules donneuses pendant une période de culture prolongée permet de cibler l'insertion d'un transgène ou de modifier précisément un gène. La construction moléculaire introduite contient des séquences d'ADN qui s'insèrent dans le gène endogène et le remplacent, réalisant une transgenèse «propre» dans laquelle un gène peut être remplacé par un de ses variants naturels, ou inactivé.
L'inactivation d'un gène est un objectif important pour les industries pharmaceutiques utilisant des modèles animaux pour les pathologies humaines et les essais de thérapie génique. La naissance récente de moutons transgéniques issus du transfert de noyaux de fibroblastes dans lesquels un gène du procollagène a été inactivé est un premier succès qui préfigure les applications de l'association entre le clonage et la transgenèse.
L'intégration d'un fragment d'ADN exogène est meilleure quand les cellules sont en division rapide. L'obtention de lignées de cellules embryonnaires stables et se divisant rapidement constitue une voie prometteuse pour l'utilisation de la transgenèse chez les mammifères domestiques.
Congélation d'Ovocytes : Vitrification vs. Congélation Lente
La congélation d'ovocytes a longtemps été un défi en raison des difficultés techniques liées à la congélation lente, limitant son application clinique. Cependant, la vitrification, une technique de congélation ultrarapide, a progressé rapidement et est désormais utilisée en AMP dans plusieurs pays. Les premiers résultats suggèrent une amélioration de la prise en charge, avec des résultats équivalents ou supérieurs à ceux obtenus après transfert d'embryons congelés par méthode lente.
La congélation consiste à abaisser la température des ovocytes de 37°C à -196°C (azote liquide) pour une conservation à long terme. Le réchauffement ramène les cellules à leur température initiale avant réintroduction dans l'organisme. La viabilité des cellules dépend des variations de température et de la cristallisation de l'eau, qui peuvent provoquer des déchirures membranaires et une lyse cellulaire. La survie cellulaire est d'environ 50 % en moyenne.
Il existe deux types de descente en température : la congélation lente et la vitrification. La vitrification, bien qu'éprouvée en biologie animale, a été utilisée avec retard chez l'homme en raison de l'équipement existant pour la congélation lente et du risque théorique de contamination microbienne lié au contact direct des ovocytes avec l'azote liquide. Son intérêt s'est accru avec des résultats convaincants. Elle est particulièrement adaptée aux ovocytes en raison de leur rapport volume/surface élevé. De plus, elle est économique car elle ne nécessite pas d'équipement lourd et les étapes sont manuelles, minimisant le risque de contamination microbiologique.
Les premières congélation lentes d'ovocytes chez la souris ont été publiées en 1972, avec d'excellents résultats. En 1985, la vitrification a été utilisée pour la première fois sur les embryons, confirmant l'excellente survie grâce à l'absence de cristallisation. Chez les bovins, la vitrification d'ovocytes a permis d'obtenir une descendance.
Une méta-analyse a confirmé les mauvais résultats de la congélation lente sur près de dix ans, comparés aux ovocytes frais. Le même article a souligné les premiers résultats prometteurs de la vitrification. La première naissance humaine après vitrification a été rapportée en 1999.
Des études ont comparé les résultats de l'ICSI immédiate après décoronisation des ovocytes avec la vitrification suivie d'ICSI. Les résultats montrent des taux de fécondation et de développement embryonnaire comparables entre les deux groupes. Une étude a également montré qu'il n'y a pas de différence dans l'état de santé des enfants nés après vitrification d'ovocytes par rapport à l'AMP classique.
En Italie, où la congélation des embryons est restreinte, la congélation des ovocytes, y compris la vitrification, a connu une augmentation significative. Les taux de grossesse ont progressé avec l'amélioration des techniques de congélation ovocytaire.
L'approche actuelle favorise l'utilisation de mélanges de cryo-protecteurs pour diminuer la toxicité et leur substitution par des substances osmotiquement actives. L'évaluation des risques de contamination microbiologique a conduit à l'utilisation de paillettes de haute sécurité. Les évaluations précliniques et cliniques sont rassurantes, sans risque spécifique attendu.
Une meilleure efficacité de la vitrification par rapport à la congélation lente a également été démontrée sur des morulae et des blastocystes. Cette technique autorise l'autoconservation d'ovocytes chez les femmes en âge de procréer, évitant les difficultés conceptuelles liées à la congélation des embryons.
La vitrification permet de diminuer la fréquence des traitements hormonaux et des ponctions chirurgicales. Elle permet de «sauver» les ovocytes non fécondés le jour de la ponction en cas d'absence de spermatozoïdes. Elle offre une offre de soins plus appropriée à la demande des couples, évitant la constitution d'un stock d'embryons surnuméraires.
La nouvelle législation européenne plaide en faveur de cette approche, car la vitrification ovocytaire réduit les risques pour la santé des femmes en diminuant le nombre de traitements hormonaux et d'actes chirurgicaux. Cette technique s'inscrit dans l'esprit général de la loi relative à la bioéthique qui exige de s'assurer de la préservation de la santé des femmes et de la fertilité.
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