L’Intra Cytoplasmic Sperm Injection (ICSI) représente une avancée significative dans le domaine de la reproduction équine. Cette technique de biotechnologie, qui consiste à injecter directement un spermatozoïde dans un ovocyte mature, offre de nouvelles perspectives pour améliorer la génétique équine et surmonter les problèmes de fertilité. Bien que l'ICSI ne soit pas une spécificité de l'espèce équine, son application chez les chevaux présente des défis et des opportunités uniques. Cet article explore en profondeur le protocole ICSI chez la jument, les défis associés, les aspects administratifs et les perspectives d'avenir de cette technique en France et à l'étranger.
Introduction à l'ICSI
L'ICSI est une biotechnologie de la reproduction qui consiste à féconder un ovocyte en lui injectant directement un spermatozoïde dans son cytoplasme. L’ovocyte ainsi fécondé est mis en développement dans un milieu de culture pendant environ 5-6 jours afin qu’il atteigne le stade embryonnaire lui permettant d’être transféré dans un utérus ou bien d’être congelé en vue d’un transfert ultérieur. Cette méthode est particulièrement utile lorsque la fécondation in vitro (FIV) classique n'est pas envisageable, notamment en cas de faible qualité de la semence.
Historique et contexte
Le premier bébé issu d’ICSI est né en 1991. Dans l’espèce équine les études scientifiques sur le sujet ont débuté à la fin des années 90. Dans cette espèce, la fécondation in vitro classique ne donne pas de résultats satisfaisants d’où l’intérêt de développer l’ICSI pour les reproducteurs ayant une grande valeur génétique mais étant peu ou pas fertiles.
Indications de l'ICSI chez la jument
Il est possible d’avoir recours à l’ICSI dans le cas de juments ayant des problèmes d’ovulation (le follicule se lutéinise sans libérer l’ovocyte) ou de tractus génital (oviducte ou utérus) empêchant la remontée des spermatozoïdes vers l’ovocyte, le transport de l’embryon vers l’utérus ou le développement de l’embryon dans l’utérus. C’est aussi le cas pour des étalons ayant une semence de mauvaise qualité ou des étalons morts pour lesquels le stock de paillettes congelées ne permet pas de fournir un grand nombre de juments. On pourrait également penser à l’ICSI pour une jument qui meure accidentellement. Ces ovaires pourraient être prélevés post mortem pour être amenés au centre de biotechnologie afin de prélever les ovocytes et les féconder par ICSI.
Protocole ICSI chez la Jument
La procédure d'ICSI chez la jument implique plusieurs étapes clés, allant de la récolte des ovocytes à l'implantation de l'embryon.
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1. Récolte des Ovocytes
La collectes des ovocytes se fait par ponction transvaginale échoguidée sur la jument debout, sédatée et analgésiée. Le fluide folliculaire des follicules de plus de 10mm est aspiré et observé sous loupe binoculaire pour la recherche des ovocytes. Si la jument est ponctionnée sur le lieu du laboratoire de biotechnologie, les ovocytes sont cultivés immédiatement après la collecte dans un milieu de maturation en incubateur à 38.5° pendant 26-28h afin qu’ils atteignent le stade nucléaire apte à la fécondation. Cette étape mime ce qu’il se passerait in vivo dans le follicule juste avant l’ovulation. Si la jument est collectée dans une clinique vétérinaire qui est éloignée du laboratoire, les ovocytes sont transportés dans une enceinte maintenant une température de 20-22°C. Après le transport, ils sont mis en maturation dans un milieu de culture en incubateur pendant 26-28h comme précédemment. Après cette étape de maturation, les cellules entourant l’ovocyte sont mécaniquement retirées puis l’ovocyte est observé sous microscope afin de visualiser son stade nucléaire. S’il a atteint le stade métaphase II, il pourra alors être fécondé par ICSI. S’il n’a pas atteint ce stade, il ne pourra pas être utilisé et sera alors perdu.
Détails de la ponction transvaginale
La jument donneuse est placée dans une barre de contention et est tranquillisée et analgésiée afin d’éviter toute douleur. Un premier opérateur introduit dans le vagin une sonde échographique et va en parallèle, via le rectum, maintenir l’ovaire et le placer devant cette sonde de manière à pouvoir voir les tissus ovariens sur l’échographe. Un second opérateur va introduire, dans un guide situé le long de la sonde échographique, une aiguille permettant de transpercer les follicules et d’aspirer le liquide folliculaire pour récupérer les ovocytes. Les ovocytes équins étant attachés à la paroi du follicule, il est nécessaire de procéder par rinçages successifs de la cavité folliculaire et, par des mouvements rotatifs de l’aiguille, l’opérateur va gratter la paroi du follicule. Un troisième opérateur s’assure du confort de la jument et reste vigilant au moindre signe de souffrance de l’animal. Il pourra être amené à réaliser de nouvelles injections de tranquillisant et/ou analgésiant. Cette personne peut également transmettre les fluides collectés au fur et à mesure au laboratoire.
2. Maturation des Ovocytes in Vitro
Une fois collectés, les liquides sont filtrés puis observés sous loupe binoculaire placée dans une hotte à flux laminaire horizontal pour rester dans un environnement stérile. Les ovocytes immatures récoltés sont mis en maturation dans des conditions atmosphériques particulières (5% de CO2, 38,5°C) pendant 28 à 30 heures. L’objectif de cette étape est l’obtention d’un ovocyte apte à la fécondation, correspondant au stade métaphase II, où une partie du matériel génétique a été expulsé dans le globule polaire.
3. Injection du Spermatozoïde (ICSI)
La semence (fraiche ou congelée) doit être préparée selon un protocole précis. Un spermatozoïde sera choisi « au hasard » et injecté dans un ovocyte. Cette étape se fait sous microscope à l’aide de joysticks et manettes de micromanipulation. Grâce à un système de micromanipulateurs montés sur un microscope, l’ovocyte est maintenu en place et un spermatozoïde est injecté directement à l’intérieur via une pipette d’injection. Au préalable de cette injection, les spermatozoïdes sont ralentis dans un milieu visqueux et leur flagelle est immobilisé pour permettre leur aspiration dans la pipette et l’injection sans risquer de provoquer des dégâts sur le cytosquelette du cytoplasme.
Étapes de l'ICSI
Les différentes étapes de l’ICSI sont :
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- Aspiration du spermatozoïde
- Introduction de la pipette dans l’ovocyte
- Injection du spermatozoïde
- Retrait de la pipette
4. Développement des Ovocytes Fécondés in Vitro
Une fois l’injection du spermatozoïde dans l’ooplasme réalisée, les ovocytes fécondés sont de nouveau placés dans un incubateur. La culture va durer au minimum 7 jours dans une atmosphère à 5% de CO2 et 5% d’O2, à une température de 38,5°C.
5. Transfert ou Congélation de l'Embryon
L’ovocyte est ensuite placé dans un milieu de culture, puis incubé à 38,5°C pendant environ 7 jours afin qu’il atteigne le stade blastocyste. Le pourcentage de clivage après injection du spermatozoïde peut atteindre 70% pour les manipulateurs expérimentés. A ce stade 2 possibilités pour l’embryon : soit il est transféré immédiatement dans l’utérus d’une jument receveuse synchrone (J5-J6 de sa propre ovulation), soit il est congelé pour être transféré ultérieurement quand une receveuse synchrone se présente ou que les conditions d’élevage le permettent (saison de reproduction par exemple).
Défis et Difficultés de l'ICSI
La technique d’ICSI présente plusieurs difficultés :
- La microinjection peut créer des dommages sur les ovocytes qui perturbent le développement de l’embryon.
- Cette technique nécessite un matériel spécifique couteux et un personnel formé et expérimenté.
- La microinjection ne peut être réalisée que sur un ovocyte à la fois, c’est donc une technique chronophage.
Toutefois, bien que les rendements obtenus soient faibles et que la technique reste coûteuse pour un éleveur, l’ICSI reste la technique de choix pour produire des embryons équins in vitro si on compare avec la fécondation in vitro classique.
Facteurs Influant sur la Réussite de l'ICSI
Plusieurs facteurs peuvent influencer négativement les résultats. En effet, la qualité de l’ovocyte diminue avec l’âge de la jument donneuse. La saison peut également influer. Les résultats sont diminués lors de l’anoestrus profond de la jument. De plus, la qualité de la semence de l’étalon utilisé peut aussi entrer en ligne de compte ou encore le nombre d’étalons utilisés sur une même séance d’ICSI, entraînant un temps de préparation de la semence plus long et donc un temps d’attente des ovocytes également plus long. Cependant, il faut souligner qu’indépendamment de tous ces facteurs de variation, il y a un effet « jument » inévitable.
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Risques Associés à la Ponction Ovocytaire
L’utilisation de la ponction ovocytaire est une technique assez invasive qui n’est pas sans risques. Même si ceux-ci sont faibles, il est important de noter : atteinte de l’ovaire, infection de l’ovaire ou de l’abdomen, problèmes suite aux injections médicales.
Résultats Attendus et Statistiques
- Le taux de collecte des ovocytes par ponction transvaginale sur des follicules immatures est en moyenne de 50%. Il peut atteindre 60% pour une équipe de ponction expérimentée avec du matériel performant.
- Le taux de maturation in vitro des ovocytes se situe entre 65 et 70% si les ovocytes sont mis en incubateur à la suite de la collecte. Ce taux est légèrement inférieur (55-60%) si les ovocytes sont transportés 24 heures avant l’incubation.
- Après la fécondation par ICSI, le taux de blastocystes obtenus lors du développement in vitro est beaucoup plus faible, de l’ordre de 17 à 20%.
- Au final, le nombre de blastocystes obtenus en moyenne par séance de ponction est de 1,2.
Facteurs Affectant Négativement la Réussite de l'ICSI
- L’âge de la jument donneuse : au-delà de 20 ans la qualité des ovocytes des juments est moindre.
- Les causes de l’infertilité de la jument : certaines causes pourraient être reliées à la pauvre qualité des ovocytes.
- L’utilisation d’étalon subfertile : le pourcentage de développement embryonnaire est plus faible pour certains étalons.
- L’utilisation de plusieurs étalons pour une même session d’ICSI : ceci est probablement dû au temps nécessaire qu’il faut pour préparer les différentes semences, puisque les ovocytes attendent pendant ce temps !
- La saison : certaines études montrent un effet négatif sur le développement embryonnaire dans le fait de réaliser les ponctions pendant l’hiver.
ICSI en France: État Actuel et Perspectives
Où en est-on en France ? La technique d’ICSI n’est pas encore développée en France bien que la filière équine soit de plus en plus demandeuse de cette biotechnologie de la reproduction. Le fait de ne pas proposer cette prestation en France engendre un coût supplémentaire pour un éleveur dont la jument est mise à la reproduction en utilisant cette technique.
Aujourd’hui, quelques centres réalisent des ponctions transvaginales écho-guidées en France. Les ovocytes sont ensuite conditionnés dans un milieu spécifique et envoyés à l’étranger, notamment en Italie, dans des laboratoires spécialisés réalisant la technique d’ICSI en routine. Les blastocystes obtenus sur place au laboratoire peuvent être soit transférés immédiatement si le centre réalise des transferts d’embryons, soit congelés et donc renvoyés en France pour leur transfert ultérieur.
En ce qui concerne la procédure d’ICSI, il n’existe pas à ce jour de laboratoire spécialisé en France. Plusieurs centres sont équipés du matériel de micromanipulation mais le geste technique d’ICSI nécessite un long apprentissage pour être totalement maîtrisé.
Considérations Importantes pour les Éleveurs
Cependant, avant de se lancer dans ce genre de technologie pour mettre sa jument à la reproduction, il faut avoir plusieurs choses en tête et le centre de reproduction se doit d’informer les éleveurs sur ces sujets :
- Obtenir un poulain en utilisant cette biotechnologie représente un coût très important pour un éleveur. Le futur poulain doit avoir de la valeur pour justifier ce coût.
- La ponction transvaginale échoguidée pour récupérer les ovocytes est une technique assez invasive qui n’est pas sans risque. Même si ces risques sont faibles, il est important de les noter : atteinte de l’ovaire, infection de l’ovaire ou de l’abdomen, problème suite aux injections médicales.
- L’éleveur doit se renseigner auprès du studbook dans lequel il veut inscrire son futur poulain pour savoir s’il y sera inscriptible ou pas avec cette technique de reproduction.
Aspects Administratifs et Réglementaires
Du côté du SIRE, des réflexions sont menées pour pouvoir permettre de déclarer des naissances plusieurs années après la conception de l’embryon. De plus, il reste encore une question à résoudre : comment gérer l’administratif et la gestion des saillies de poulains nés plusieurs années après la fécondation par ICSI ? Le SIRE travaille actuellement sur cette problématique…
Face à l’engouement de la filière pour cette technique, les étalonniers s’organisent et proposent maintenant des contrats de vente de paillettes spécifiquement pour l’ICSI.
Bien-être Animal et Considérations Éthiques
Les établissements d'expérimentation animale rédigent des résumés non techniques (RNT) à des fins de communication. Ces résumés sont donc soumis, au minimum, au biais de désirabilité sociale, qui peut avoir pour conséquence de mettre en avant de manière détaillée les bénéfices attendus et de limiter les détails et la description des contraintes imposées aux animaux.
Application de la règle des "3R"
La règle des "3R" (Remplacement, Réduction, Raffinement) est appliquée pour minimiser l'impact sur les animaux.
- Remplacement: La technique d’ICSI est connue dans plusieurs espèces animales et publiée. Le laboratoire connaît bien la façon de traiter les cellules et les cultiver.
- Réduction: Le nombre d’animaux sera limité au nombre nécessaire à réaliser des prélèvements d’ovocytes jusqu’à ce que la technique soit validée et standardisée.
- Raffinement: Un programme d’enrichissement sera mis en place. Ce dernier comprendra des enrichissements structuraux (congénère dans le box adjacent pour un contact visuel, olfactif et sonore permanent, une pierre à sel laissée à disposition), une litière confortable et épaisse de paille pour le repos en décubitus, un jouet (ballon), des friandises (carottes, bonbons) distribués quotidiennement par les soigneurs, de la musique d’ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress.
Mesures de Précaution et de Suivi
Les juments, issues d’un troupeau à visée pédagogique, seront déjà acclimatées à leur environnement (lieu de vie, pré et boxe, personnel, congénères) depuis plusieurs mois et ont déjà bénéficié d’une période d’habitation (training aux actes techniques et manipulations) avant le début du projet. Ce programme d’habituation est associé à du renforcement positif (ex : distribution de récompenses) ce qui permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations. Les animaux seront suivis individuellement et trois fois par jour tout au long de l’étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. Un examen échographique de contrôle des ovaires et de l’utérus sera effectué à 24h post-aspiration. Le personnel soignant veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal. Les temps de repos accordés aux juments entre les prélèvements respecteront les recommandations éthiques en vigueur au sein de l’établissement utilisateur. Les prélèvements seront réalisés sous sédation et analgésie. Un traitement analgésique post-opératoire sera également mis en place.
Les prélèvements ovocytaires seront réalisés sur animal vigile et sédaté, car l’anesthésie générale engendre un stress et un risque plus important pour l’animal que la procédure elle-même. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge et hospitalisé en clinique spécialisée, selon les recommandations du vétérinaire.
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