Introduction
Le dosage ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) de l'hCG (gonadotrophine chorionique humaine) est une technique de laboratoire largement utilisée pour la détection et la quantification de cette hormone dans divers fluides biologiques, notamment le sérum, le plasma et l'urine. L'hCG est une hormone glycoprotéique produite par le placenta en développement pendant la grossesse. Son dosage est essentiel pour le diagnostic de grossesse, le suivi de la grossesse, le dépistage de certaines anomalies fœtales (comme la trisomie 21) et le diagnostic de certaines tumeurs. Cet article détaille la fiche technique du dosage ELISA hCG, en abordant les principes, les réactifs, la procédure et les considérations importantes.
Principes Fondamentaux du Dosage ELISA hCG
L'ELISA est une méthode biochimique qui détecte la présence d'une substance, généralement un antigène, dans un échantillon. Le dosage ELISA hCG repose sur une réaction immunologique spécifique entre l'hCG et un anticorps anti-hCG. Il existe différents types d'ELISA, notamment l'ELISA direct, indirect, sandwich et compétitif. Le type le plus couramment utilisé pour le dosage de l'hCG est l'ELISA sandwich, qui offre une haute sensibilité et spécificité.
Dans un ELISA sandwich, un anticorps spécifique à l'hCG est fixé sur une plaque de microtitration. L'échantillon contenant potentiellement l'hCG est ajouté à la plaque, permettant à l'hCG de se lier à l'anticorps fixé. Après un lavage pour éliminer les composants non liés, un deuxième anticorps anti-hCG, conjugué à une enzyme (par exemple, la peroxydase de raifort), est ajouté. Cet anticorps se lie à l'hCG déjà capturée sur la plaque. Après un autre lavage, un substrat spécifique à l'enzyme est ajouté. La réaction enzymatique produit un changement de couleur, dont l'intensité est proportionnelle à la quantité d'hCG présente dans l'échantillon. La concentration d'hCG est ensuite déterminée en comparant l'absorbance de l'échantillon à une courbe d'étalonnage réalisée avec des standards d'hCG de concentrations connues.
Réactifs et Matériels Nécessaires
Un kit ELISA hCG typique contient les éléments suivants :
- Plaque de microtitration: Recouverte d'anticorps spécifiques à l'hCG. La plaque est généralement composée de 96 puits.
- Standards hCG: Solutions d'hCG de concentrations connues, utilisées pour établir la courbe d'étalonnage. Le standard peut être une protéine recombinante ou une protéine naturelle. L'expression de la protéine peut être réalisée dans des systèmes tels que E.coli, la levure ou des cellules de mammifères.
- Anticorps de détection (Réactif de Détection A et B): Anticorps spécifiques à l'hCG, conjugués à une enzyme (par exemple, la peroxydase de raifort). Le réactif de Détection A et le réactif de Détection B peuvent être lyophilisés et doivent être reconstitués avant utilisation.
- Diluant de standard: Utilisé pour diluer les standards hCG et préparer la courbe d'étalonnage. Le diluant de standard contient généralement un conservateur comme l'azide de sodium (0.02 %).
- Diluants d'essai (Assay Diluent A et B): Utilisés pour diluer les anticorps de détection. Ils contiennent souvent un conservateur comme l'azide de sodium (0.01 %).
- Solution de lavage: Tampon utilisé pour laver la plaque entre les étapes afin d'éliminer les réactifs non liés. La solution de lavage est souvent du TBS (Tris-Buffered Saline). Un concentré de solution de lavage (par exemple, 30x) doit être dilué avec de l'eau déionisée ou distillée pour obtenir une solution de travail (1x).
- Solution de substrat (TMB): Substrat de l'enzyme conjuguée à l'anticorps de détection. Le TMB (3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine) est un substrat couramment utilisé qui produit un produit coloré lors de la réaction enzymatique. Il est important de ne pas remettre la solution résiduelle dans le flacon après avoir aspiré la quantité nécessaire.
- Solution d'arrêt: Utilisée pour arrêter la réaction enzymatique. La solution d'arrêt est généralement de l'acide sulfurique (H2SO4) à une concentration de 1 mol/L.
- Autres matériels: Pipettes, embouts de pipette stériles, tubes à microcentrifugeuse, agitateur, lecteur de microplaques.
Protocole Expérimental Détaillé
- Préparation des Réactifs:
- Amener tous les composants du kit et les échantillons à température ambiante (18-25 °C) avant utilisation.
- Reconstituer le Standard avec 1.0 mL de Diluant de Standard, maintenir pendant 10 minutes à température ambiante, agiter doucement (sans mousser). La concentration du standard dans la solution mère est de 100 ng/mL. Diluer d'abord la solution mère à 50 ng/mL, ce standard dilué servant de standard le plus élevé (50 ng/mL).
- Préparer une série de dilutions en cascade en utilisant le diluant de standard. Par exemple, préparer 7 tubes contenant 0.5 mL de diluant de standard et utiliser le standard dilué pour produire une série de dilutions doubles. Mélanger soigneusement chaque tube avant le transfert suivant. Préparer 7 points de standard dilué tels que 50 ng/mL, 25 ng/mL, 12.5 ng/mL, 6.25 ng/mL, 3.12 ng/mL, 1.56 ng/mL, 0.78 ng/mL, et un dernier tube à microcentrifugeuse avec du diluant de standard servant de blanc à 0 ng/mL.
- Reconstituer le Réactif de Détection A avec 150 μL de Diluant de Réactif, maintenir pendant 10 minutes à température ambiante, agiter doucement (sans mousser) si lyophilisé. Centrifuger brièvement les solutions de Détection A et Détection B avant utilisation. Diluer les réactifs de détection A et B à la concentration de travail 100 fois avec les Diluants d'Essai A et B, respectivement.
- Diluer la Solution de Lavage concentrée (30x) : Diluer 20 mL de solution concentrée avec 580 mL d'eau déionisée ou distillée pour préparer 600 mL de solution de lavage (1x).
- Préparation des Échantillons:
- Recueillir les échantillons de sérum, de plasma ou d'urine selon les procédures standard.
- Centrifuger les échantillons pour éliminer les particules et les débris.
- Diluer les échantillons si nécessaire avec le diluant approprié. Le facteur de dilution recommandé est donné à titre indicatif uniquement. Estimer la concentration des échantillons avant de réaliser le test.
- Stocker les échantillons à court terme à 2-8 °C ou aliquoter à -20 °C (≤ 1 mois) ou -80 °C (≤ 3 mois). Éviter les cycles répétés de congélation-décongélation. Décongeler lentement les échantillons congelés avant le test et centrifuger pour éliminer les précipités.
- Réalisation du Dosage:
- Ajouter 100 μL de standard ou d'échantillon à chaque puits de la plaque.
- Incuber pendant 1 heure à 37 °C.
- Aspirer le contenu des puits et ajouter 100 μL de Réactif de Détection A préparé.
- Incuber pendant 1 heure à 37 °C.
- Aspirer et laver 3 fois avec la solution de lavage.
- Ajouter 100 μL de Réactif de Détection B préparé.
- Incuber pendant 30 minutes à 37 °C.
- Aspirer et laver 5 fois avec la solution de lavage.
- Ajouter 90 μL de Solution de Substrat.
- Incuber pendant 10-20 minutes à 37 °C. Surveiller l'apparition de la couleur.
- Ajouter 50 μL de Solution d'Arrêt pour stopper la réaction.
- Lecture et Analyse des Résultats:
- Lire l'absorbance de chaque puits à une longueur d'onde appropriée (généralement 450 nm) à l'aide d'un lecteur de microplaques.
- Calculer la moyenne des absorbances pour chaque série de standards, de contrôles et d'échantillons en double, et soustraire la densité optique moyenne du standard zéro.
- Tracer la courbe d'étalonnage sur papier millimétré log-log ou à l'aide d'un logiciel (par exemple, Sigma Plot), avec la concentration du standard sur l'axe des x et l'absorbance sur l'axe des y. Tracer la meilleure ligne droite à travers les points standard.
- Déterminer la concentration d'hCG dans les échantillons en comparant leur absorbance à la courbe d'étalonnage.
- Multiplier la concentration obtenue par le facteur de dilution utilisé pour l'échantillon.
Contrôles de Qualité et Validation
- Sensibilité: La dose minimale détectable d'hCG est généralement inférieure à 50 pg/mL.
- Reproductibilité: Les coefficients de variation intra-essai et inter-essai doivent être inférieurs à 10 %.
- Exactitude: Évaluer l'exactitude en utilisant des matériaux de référence certifiés ou en participant à des programmes de comparaison interlaboratoires.
- Recouvrement: Le recouvrement a été déterminé en ajoutant différents niveaux d'hCG humaine dans du sérum humain, du plasma et des milieux de culture cellulaire.
Précautions et Bonnes Pratiques de Laboratoire
- Manipulation des échantillons: Utiliser des gants et une blouse de laboratoire lors de la manipulation des échantillons. Manipuler les échantillons potentiellement infectieux avec précaution.
- Pipetage: Utiliser des pipettes calibrées et des embouts de pipette stériles pour assurer une distribution précise des réactifs. Pour minimiser l'imprécision causée par le pipetage, utiliser de petits volumes et s'assurer que les pipettes sont calibrées. Ne pas faire de dilutions en série directement dans les puits.
- Incubation: Maintenir des conditions d'incubation constantes (température, temps) pour assurer des résultats reproductibles. Ne pas dissoudre les réactifs directement à 37 °C.
- Lavage: Effectuer des lavages complets et uniformes entre les étapes pour éliminer les réactifs non liés.
- Contamination: Éviter la contamination croisée des réactifs et des échantillons.
- Stockage: Stocker les réactifs selon les recommandations du fabricant. Pour les kits non ouverts : Tous les réactifs doivent être stockés selon les indications sur les flacons. Le Standard, le Réactif de Détection et la plaque de 96 puits doivent être stockés à -20 °C dès réception, tandis que les autres réactifs doivent être stockés à 4 °C. Pour les kits ouverts : les réactifs restants doivent être stockés selon les conditions de stockage ci-dessus. De plus, remettre les puits inutilisés dans la pochette en aluminium contenant le dessiccant et sceller la pochette avec la fermeture éclair.
- Interprétation des résultats: Interpréter les résultats en tenant compte des valeurs de référence appropriées et des informations cliniques du patient.
- Échantillons frais: Il est recommandé d'utiliser des échantillons frais sans stockage prolongé, sinon une dégradation et une dénaturation des protéines peuvent se produire dans ces échantillons, conduisant à de faux résultats.
- Compatibilité: Si le type d'échantillon n'est pas spécifié dans les instructions, un test préliminaire est nécessaire pour déterminer la compatibilité avec le kit.
- Lyse cellulaire: Si un tampon de lyse est utilisé pour préparer des homogénats de tissus ou un surnageant de culture cellulaire, il existe une possibilité de provoquer une déviation due à la substance chimique introduite.
- Solution d'arrêt: La Solution d'arrêt suggérée pour une utilisation avec ce kit est une solution acide.
- Reconstitution: Reconstituer soigneusement les Standards ou les Réactifs de Détection A et B de travail conformément aux instructions, et éviter de faire mousser et mélanger doucement jusqu'à ce que les cristaux soient complètement dissous.
Applications Cliniques du Dosage ELISA hCG
Le dosage ELISA hCG est utilisé dans diverses applications cliniques, notamment :
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- Diagnostic de grossesse: La détection de l'hCG dans le sérum ou l'urine est un indicateur précoce de grossesse.
- Suivi de la grossesse: Le dosage séquentiel de l'hCG peut être utilisé pour surveiller la progression de la grossesse et détecter d'éventuelles complications, telles que les grossesses ectopiques ou les fausses couches.
- Dépistage de la trisomie 21: L'hCG est utilisée dans le cadre du dépistage de la trisomie 21 (syndrome de Down) chez le fœtus.
- Diagnostic et suivi des tumeurs trophoblastiques: L'hCG est un marqueur tumoral pour les tumeurs trophoblastiques, telles que les choriocarcinomes.
- Surveillance après une fausse couche ou une interruption de grossesse: Pour s'assurer que les niveaux d'hCG reviennent à la normale.
- Diagnostic différentiel de certaines affections: Dans certains cas, l'hCG peut être produite par des tumeurs non trophoblastiques, ce qui peut aider au diagnostic différentiel.
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