Si certains animaux possèdent des capacités de régénération remarquables, ces capacités sont pratiquement inexistantes chez les mammifères. Cependant, des études récentes ont révélé que l'embryon de souris peut régénérer un membre entier, mais seulement pendant une courte période. Cette découverte soulève des questions fascinantes sur la possibilité de réactiver cette capacité perdue. De plus, des avancées significatives ont été réalisées dans la création de modèles d'embryons de souris à partir de cellules souches, offrant de nouvelles perspectives pour la recherche sur le développement embryonnaire.
La capacité de régénération chez l'embryon de souris
La régénération est une capacité spectaculaire mais rare dans le règne animal. L’axolotl en est l’exemple le plus connu. Cet amphibien peut faire repousser une patte, son cœur, sa moelle épinière, ou même une partie de son cerveau, le tout sans cicatrice. D’autres espèces, comme certaines salamandres, les étoiles de mer ou les lézards, peuvent aussi régénérer des extrémités. Chez les mammifères, en revanche, cette faculté est presque inexistante. À l’âge adulte, seul le cerf est connu pour faire repousser ses bois.
Dans les années 90, des scientifiques ont mis en évidence un autre cas qui était resté inexploré jusqu'à maintenant : à un stade très précoce de leur développement, des embryons de souris peuvent régénérer un membre amputé. À l’époque, on observait bien une repousse, mais sans savoir s’il s’agissait réellement d’une régénération complète fidèle à la structure initiale.
Dans une nouvelle étude parue dans PNAS, des scientifiques ont repris ces travaux en surmontant les difficultés techniques liées à l’étude d’embryons in utero en les cultivant en laboratoire. Ils montrent que cette capacité de régénération n’existe que pendant une fenêtre extrêmement courte : à dix jours de développement, le membre repousse ; à douze jours, la régénération ne fonctionne plus.
Le rôle des cellules de la crête neurale
Comme l’explique Farida Djouad, co-autrice de l’étude, ce sont ces cellules dérivées de la crête neurale qui rendent cette régénération possible. Trois heures après l’amputation, elles migrent vers la zone lésée et participent à la reconstruction du membre. Mais avec le développement, ces cellules se spécialisent en neurones, en cellules osseuses, en cellules du cartilage ou pigmentaires, et perdent leur capacité de régénération.
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Toute la question est désormais de savoir s’il est possible de redonner à des cellules une "seconde jeunesse", de retrouver cet état régénératif. C’est l’objectif du projet ICHONDRO : produire en laboratoire, sans recourir à des embryons, des cellules humaines proches de celles de la crête neurale, et tester, un jour, leur capacité de régénération chez des patients atteints de maladies dégénératives comme l’arthrose.
Création d'embryoïdes de souris à partir de cellules souches
Des modèles d’embryons de souris, sans l’aide d’ovules ni de spermatozoïdes : c’est ce qu’ont réussi à obtenir deux équipes de chercheurs, à quelques semaines d’écart. Produits à partir de cellules souches selon le même principe que les organoïdes, mini-organes cultivés en laboratoire, ces modèles d’embryons sont nommés « embryoïdes », car ils n’ont pas toutes les caractéristiques d’un embryon classique. Mais ils leur ressemblent assez pour être particulièrement utiles à la recherche.
Début août, l’équipe de Jacob Hanna, chercheur de l’institut Weizmann, en Israël, annonce avoir cultivé ces embryoïdes jusqu’à 8,5 jours. Et à la fin du même mois, l’équipe de Magdalena Zernicka-Goetz, de l’université de Cambridge, a rapporté une expérience similaire. En utilisant une technique d’incubation semblable à celle de l’équipe de Jacob Hanna, avec quelques modifications, elle a aussi atteint 8,5 jours. La gestation chez la souris étant d’environ 20 jours, cela représente plus d’un tiers de la gestation complète !
Ces réalisations s’appuient sur des années de recherche : « Cela fait longtemps que des chercheurs font de la culture ex vivo d’embryons de souris. Au fil du temps, ils ont mis au point les conditions de culture qui permettent d’assurer le développement », précise Laurent David, chercheur en biologie cellulaire à Nantes Université.
Les défis de la création d'embryoïdes
Afin de créer ces embryoïdes à partir de cellules souches, il restait une difficulté : pour qu’ils se développent, il est nécessaire que des cellules de placenta soient également présentes. Or des cellules souches IPS (ou pluripotentes induites, des cellules souches obtenues à partir de cellules adultes et spécialisées, et non dérivées d’un embryon) classiques ne pouvaient pas donner des cellules de placenta. Les chercheurs ont eu recours au génie génétique pour contourner cet obstacle. « Ils ont utilisé des cellules pluripotentes transgéniques dont certaines peuvent exprimer de manière transitoire des facteurs de transcription, notamment pour obtenir une ébauche de placenta.
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Applications potentielles des embryoïdes
À quoi pourront servir ces embryoïdes ? Tout d’abord, à étudier précisément l’effet des gènes dans les embryons de souris. Imaginons, par exemple, que l’on veuille étudier l’effet de quatre allèles différents lorsqu’ils sont présents ensemble. Si l’on crée un embryon de manière classique, les chances d’avoir ces quatre allèles exactement sont faibles. Tandis qu’en partant de cellules souches, on contrôle précisément les allèles présents.
Ensuite, si des modèles d’embryons humains étaient produits de manière similaire, cela permettrait de mieux comprendre le développement embryonnaire. Mais cette possibilité soulève des questions éthiques. « Il ne s’agit pas d’un embryon, donc cet embryoïde n’est pas soumis à la réglementation qui fixe la limite de la recherche sur l’embryon humain au jour 14, note Laurent David. Au niveau international, la question commence à se poser : à partir de quel stade doit-on considérer que c’est trop proche d’un embryon ? »
Des réponses devraient vite arriver : « Les sociétés savantes internationales prendront sûrement position d’ici à décembre. En France, la loi vient de changer en mars : on a le droit de développer des blastoïdes [des modèles de blastocyste, le stade embryonnaire à 5 ou 6 jours, ndlr]. Il faut donc qu’on ait une position très claire sur ce qu’on ne fera pas. Par exemple, on ne fera pas d’embryoïdes avancés en vue de réaliser des greffes d’organes, si tant est que cela soit faisable. »
En attendant ces prises de position, ces embryoïdes se retrouvent dans un flou réglementaire.
La souris comme modèle d'étude du développement embryonnaire
La souris domestique (Mus musculus) est un excellent modèle mammifère pour étudier une grande variété de caractères et de maladies, notamment ceux impliqués dans le développement. L’organisation du génome a fortement divergé entre l’homme et la souris depuis leur ancêtre commun. Environ 180 cassures et réassemblages se sont produits dans les lignées humaine et murine. Bien que le nombre de chromosomes soit similaire chez les deux espèces (23 par génome haploïde chez l’homme contre 20 chez la souris), leurs structures globales diffèrent considérablement. Néanmoins, même après ce remaniement génomique important, il existe de nombreux grands blocs d’ADN dans lesquels l’ordre des gènes est le même chez l’homme et la souris.
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L’introduction de la souris comme modèle en génétique date du début du XXème siècle, à la même époque que pour la drosophile. Dans une série d’articles de 1902 à 1905, Lucien Cuénot a utilisé des souris pour démontrer les lois de Mendel pour la première fois chez les mammifères. À peu près à la même période, William E Castle, un pionnier de l’utilisation de la drosophile pour étudier la génétique, a également commencé à étudier l’hérédité en utilisant comme phénotype la couleur du pelage chez la souris. Le laboratoire de Castle ainsi que d’autres ont lancé des programmes de recherche axés sur la génétique de la souris et ont rapidement réalisé la nécessité de créer des souches consanguines. En 1909, la première souche consanguine, DBA, a été créée et l’ère de la génétique de la souris moderne a commencé.
La souris est un excellent modèle pour étudier les étapes précoces du développement (clivage) et les étapes post-gastrulation. Pour la période juste après l’implantation correspondant à la gastrulation, les embryons ont une taille et une topologie qui les rend difficiles à étudier dans l’utérus. Des techniques récentes de culture d’embryons in vitro ont permis de faire se développer des embryons de souris jusqu’à 11 jours après fécondation soit jusqu’à l’organogenèse !
Techniques d'étude du développement embryonnaire chez la souris
Par traitement hormonal, on fait superovuler des souris femelles puis on les accouple avec un mâle. Les zygotes sont rapidement récupérés dans les voies génitales puis incubés in vitro. L’ADN d’intérêt, souvent un gène sous le contrôle d’un promoteur spécifique est injecté dans le pronucléus mâle. Puis on sélectionne les embryons qui ont poursuivi correctement leur développement et on les injecte dans l’utérus d’une femelle pseudo-gestante (la copulation provoque des stimuli mécaniques nécessaires au bon développement de l’utérus pour la gestation alors la femelle est préalablement accouplée avec un mâle vasectomisé). Les souriceaux nés doivent ensuite être sélectionnés pour la présence et l’expression du transgène. En effet, l’insertion du transgène dans le génome ne réussit pas à chaque fois et le transgène peut aussi très bien s’être inséré dans de l’hétérochromatine silencieuse. On effectue une RT-PCR ou alors un test qui permet de révéler l’expression d’un gène rapporteur s’il est présent dans le transgène (par exemple, coloration X-gal si on a mis le gène de la β-galactosidase).
Le système Cre-Lox a permis de franchir cet obstacle en rendant possible une délétion d’un gène contrôlée spatio-temporellement au cours du développement. La Cre est une recombinase du bactériophage P1 qui est capable d’exciser toute séquence située entre deux séquences LoxP.
Le développement chez la souris, comme dans d’autres modèles, est de plus en plus étudié à l’échelle transcriptomique et cellulaire par scRNAseq (analyse transcriptomique sur cellules isolées).
Facteurs impliqués dans la spécification de l'épiblaste
Après la fécondation, l'embryon de souris effectue deux phases de différenciation avant l'implantation. La première permet la formation de cellules externes qui donnent le Trophectoderme (TE) et de cellules internes qui donnent la Masse Cellulaire Interne (MCI). La deuxième se déroule dans la MCI produisant les cellules de l'Epiblaste (Epi) et l'Endoderme Primitif (EPr) disposées en « poivre et sel » au sein de la MCI. Des études récentes montrent que le facteur NANOG est nécessaire pour la spécification des cellules EPI, mais qu'il n'était pas suffisant, suggérant alors que d'autres facteurs sont impliqués dans l'initiation de cette différenciation.
Victor Nowak a étudié l'expression de facteurs potentiellement impliqués dans la spécification en épiblaste dans l'embryon de souris préimplantatoire. Il s'est intéressé au gène Fgf4, connu comme étant un marqueur de l'Epi et est un gène cible de NANOG, pour identifier in silico plusieurs facteurs potentiellement impliqués : TEAD4, SOX2, SOX21 et OCT4. L'étude de leurs expressions a mis en avant l'hétérogénéité de ces facteurs à différents stades, ainsi qu'une expression inversement corrélée entre SOX2 et SOX21 au cours du développement. Ces résultats, en plus d'une veille bibliographique, ont conduit à l'hypothèse que TEAD4 et SOX21 seraient des répresseurs alors que NANOG et SOX2 seraient des activateurs de l'expression de FGF4 et de la spécification en Epi. Il y aurait alors des mécanismes de compétition entre ces facteurs.
Manipulation du génome de la souris
Les knock-out abolissent la fonctionnalité d’un gène depuis le début de son expression. Or parfois un gène peut avoir des fonctions à différents moments du développement. S’il a un rôle vital à une phase précoce, un knock-out ne permettra pas de connaître sa fonction à des phases tardives.
Système Cre-Lox
Le système Cre-Lox peut aussi être utilisé pour faire du suivi de lignage cellulaire. L’activation d’un promoteur donné dirige l’expression de la Cre qui va réaliser la délétion d’une séquence générant un codon STOP qui empêche la production d’une protéine rapportrice fonctionnelle. Toutes les cellules qui ont activé le promoteur et aussi ses descendantes vont alors exprimer la protéine rapportrice.
Considérations éthiques et réglementaires
L’étude du développement embryonnaire est une discipline complexe et très encadrée. La recherche sur l’embryon humain est très encadrée et régie par des règles strictes de bioéthique. Elle est autorisée en France depuis 2013, sous conditions et sous contrôle de l’Agence de biomédecine. Ainsi, dans un grand nombre de pays, il est interdit de cultiver et d’utiliser des embryons humains au-delà de 14 jours après la fécondation. Afin de comprendre les processus fondamentaux mis en jeu lors du développement embryonnaire, les chercheurs ont donc orienté leurs études vers d’autres mammifères, notamment la souris.
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