La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) est une technique d'analyse couramment utilisée en chimie pour séparer et identifier les composants d'un mélange. Elle repose sur le principe de migration différentielle des composés en fonction de leur affinité pour deux phases : une phase stationnaire et une phase mobile.
Principe de la CCM
La CCM est un procédé de séparation des constituants d’un mélange. De ce phénomène appelé rétention résulte que les constituants du mélange injecté se déplacent tous moins vite que la phase mobile et que leurs vitesses de déplacement sont différentes. Le principe de séparation des composés par CCM est proche de celle en HPLC.
Les Phases en Présence
La phase stationnaire est généralement une fine couche d'adsorbant, comme la silice gelée, déposée sur une plaque en verre ou en plastique ou d'aluminium. Il existe trois principaux supports : silice, alumine et cellulose. La silice est le support le plus courant. Il est conseillé de toujours commencer par celui-là. L'alumine est un support à caractère basique. La cellulose est utilisée pour séparer les composés polaires, comme les sucres ou les acides aminés.
La phase mobile, quant à elle, est un solvant ou un mélange de solvants (appelé éluant) qui migre par capillarité à travers la couche stationnaire. Le choix de l'éluant est essentiel. On a vu que le choix dépendait de la polarité. On peut utiliser des proportions variées comme 100-0, 75-25, 50-50, 25-75, etc.
Le Mécanisme de Séparation
La séparation des composés est basée sur la différence d'affinité existant entre ces composés, la phase mobile, qui entraîne les composés, et la phase stationnaire. Les composés les moins polaires, ou apolaires (A), ont plus de facilité à l'emmener dans la phase mobile. Les interactions de type liaison hydrogène jouent un rôle décisif lors de la migration des composés. Les molécules qui ont le plus d'affinité pour l'éluant (!) seront entraînées plus loin que celles composant le support. Les liaisons hydrogènes peuvent être donneur d'hydrogène (D).
Lire aussi: Applications de la CCM
Matériel et Procédure
Préparation de la Plaque
La chromatographie sur couche mince s'effectue généralement sur une fine couche de silice (phase stationnaire) déposée sur un support. La plaque chromatographique est en général constituée de deux parties : une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice, fixée à une plaque rigide en aluminium (c'est le cas ici), en plastique ou parfois en verre.
Préparation de la Cuve et Dépôt de l'Échantillon
Introduire l'éluant jusqu'à une hauteur d'environ 0,5 cm dans la cuve à chromatographie, puis la fermer. Les vapeurs d'éluant vont alors saturer la cuve. On place environ 10 mL d'éluant dans la cuve à chromatographie, afin d'avoir un demi centimètre d'éluant au fond de celle-ci. La cuve de chromatographie est ensuite refermée par un couvercle. Pour une meilleure séparation, on peut placer un papier filtre sur toute la hauteur de la cuve. La cuve doit être munie d'un couvercle.
Si les composés à analyser sont sous forme solide, les dissoudre dans un minimum de solvant. On trace un trait au crayon de papier à environ 1,5 cm du bas de la plaque, sans appuyer et sans y laisser ses empreintes. Tracer au crayon un trait à 1 cm du bas de la plaque, où seront déposés les taches. Le dépôt de l'échantillon se fait à l'aide d'un capillaire fabriqué in situ avec en tube en verre. Il existe des capillaires possibles.
L'étape importante de cette manipulation est le dépôt des espèces chimiques sur la plaque. On dépose à l'aide d'un capillaire les espèces à séparer, diluées dans un solvant, si possible identique à l'éluant ou suffisamment volatil, au niveau de la ligne de dépôt en réalisant des dépôts séparés de 1 à 2 cm entre eux et du bord de la plaque. Il est important de ne pas appuyer le capillaire sur la plaque afin de ne pas la creuser. Il est possible de répéter le dépôt plusieurs fois afin d'augmenter la quantité d'espèces chimiques déposées sans élargir les taches. Chaque dépôt doit révéler le maximum d'information. Dans un angle de la plaque, on réalise la tache.
Développement de la Chromatographie
Placer verticalement la plaque dans la cuve, et la refermer rapidement. Au départ, l'éluant ne doit pas toucher les dépôts. SANS BOUGER LA CUVE, attendre que l'éluant soit arrivé à environ 1 cm du bord supérieur. La vitesse à laquelle l'éluant diffuse dépend du support et de l’éluant.
Lire aussi: Principe de la CCM
L'éluant migre sur la plaque de silice par capillarité et entraîne les composés du mélange étudié. Lorsque le front de solvant arrive à deux centimètres du haut de la plaque, on la retire et on repère immédiatement par un trait ce front, afin d'indiquer l'endroit où l'éluant est parvenu. Ne pas oublier de tracer le front du solvant dès la sortie de la plaque de la cuve avant son évaporation.
Révélation des Composés
La plaque de chromatographie est ensuite lue directement si les composés sont visibles, ou placée sous une lumière UV. La plupart sont incolores, il faut les révéler. Les produits peuvent également être révélés en pulvérisant la plaque une solution d'acide sulfurique suivi d'un chauffage dans une étuve ou sur une plaque chauffante. Des plaques avec révélateurs à la fluorescéine sont également disponibles. Placées sous la lumière UV, les taches apparaissent sans avoir besoin d'avoir recours à un révélateur.
Les dérivés aromatiques absorbent dans l'UV. On place la plaque sous une lampe UV et entourer les taches colorés. Les aldéhydes donnent une coloration jaune-marron en présence d'iode. Pour cela, mettre la plaque et quelques cristaux d'iodes, puis boucher. Les composés insaturés réagissent avec le permanganate de potassium en solution (taches noires). Les phospholipides peuvent être révélés par pulvérisation d'une solution de molybdène en présence de sulfate de cérium. Il faut éviter toute formation de goutelettes. Il est préférable d'appliquer en plusieurs pulvérisations.
Calcul du Rapport Frontal (Rf)
On détermine le ratio frontal Rf = L1/L2 étant le rapport entre la distance parcourue par le soluté divisé par la distance parcourue par le front du solvant. Le Rf est habilement traduit comme Rapport frontal. Le Rf est caractéristique d'un composé dans des conditions de support et d'éluant donnés.
CCM bidimensionnelle
Pour l'hydrolyse d'une protéine ou pour séparer un grand nombre de composés que l'on veut séparer, on peut utiliser une CCM bidimensionnelle. On laisse éluer dans un premier éluant. Puis, on laisse éluer dans un second éluant. On obtient alors une cartographie de la protéine.
Lire aussi: CCM : Guide complet
Applications de la CCM
La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) trouve son application dans des domaines tels que :
- Le contrôle de qualité, dans lequel elle permet de vérifier la pureté des produits et de s'assurer de l'absence de contaminants.
- L’identification de composés, où cette technique est utilisée pour identifier les composants d'un mélange inconnu en les comparant à des composés de référence.
- La séparation des couleurs d'un feutre.
- L'identification des acides aminés de l'aspartame.
- Tester ses produits, c’est s’assurer de ce qu’ils contiennent, pour éviter les surdoses, les mauvaises surprises ou d’ingérer des produits de coupe toxiques.
La loi de modernisation du système de santé adoptée en 2016 reconnaît aux intervenants la mission d’analyse de produits. Suite à l’interdiction d’utilisation des tests colorimétriques, des associations comme Médecins du monde ont mis au point des techniques d’analyse sur site basées sur la CCM.
Avantages et Inconvénients de la CCM
Avantages
La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) présente de nombreux avantages qui en font une technique d'analyse appréciée :
- Simplicité et rapidité : La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) est une technique relativement simple à mettre en œuvre et ne requiert qu'un matériel peu encombrant.
- Polyvalence : La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) peut être utilisée pour analyser une large gamme de composés, organiques et inorganiques.
- Faible coût : La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) est une technique relativement peu coûteuse à mettre en œuvre, ce qui la rend accessible à un large public.
- Le principal intérêt de la CCM est l'identification rapide des composés d'un mélange.
Inconvénients
- L'analyse est uniquement qualitative et ne permet pas le dosage d'un composé. Toutefois, ceci est de moins en moins vrai avec l'apparition de chomatographie sur couche mince haute performance (HPTLC).
- Elle ne permet pas de quantifier les principes actifs ni les adultérants (les produits de coupe) contenus dans l’échantillon.
- Mais il peut y avoir présence associée de molécules ne permettant pas une identification formelle (en gros, c’est pas toujours hyper précis).
CCM et Réduction des Risques
Le principe de la réduction des risques (RdR) vise, en partie, à informer les usagers concernant leurs usages, leurs modes de consommation et les risques liés aux produits qu’ils consomment. La CCM est une méthode qui peut permettre facilement d’identifier une poudre pure contenant un composé bien connu (cocaïne, héroïne, MDMA, etc.), mais ces poudres pures ne circulent que très rarement.
Humeau : Plaques CCM et Accessoires
Humeau, distributeur d'équipements de laboratoire, propose sur son site e-commerce une gamme complète de plaques CCM et d'accessoires, répondant aux besoins variés des professionnels et des chercheurs. Humeau propose une large gamme de plaques CCM et d'accessoires de qualité pour répondre aux besoins spécifiques de ses clients. Les plaques CCM sont disponibles en différentes formes, tailles et phases stationnaires pour s'adapter à tous types d'analyses.
Autres Techniques Chromatographiques
Il est important de noter que la CCM n'est qu'une des nombreuses méthodes chromatographiques disponibles. D'autres techniques, telles que la chromatographie en phase gazeuse (CPG) et la chromatographie liquide haute performance (HPLC), sont utilisées pour des applications spécifiques.
Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)
Dans des conditions chromatographiques données, le "temps de rétention" (temps au bout duquel un composé est élué de la colonne et détecté), caractérise qualitativement une substance. Lorsque les conditions opératoires sont connues, la CCM permet un contrôle aisé et rapide de la pureté d’un composé organique. Le principe de la séparation par CPG consiste à partager l'échantillon à analyser entre deux phases. Il permet de mettre en évidence le passage des différents gaz séparés par la colonne.
Détecteurs en CPG
- TCD conductibilité thermique appelé catharomètre. Il est basé sur la mesure des variations de conductibilité thermique des mélanges gazeux en fonction de leur composition.
- FID, détecteur à ionisation de flamme. C’est un détecteur beaucoup plus sensible que le catharomètre, mais il ne donne de réponse qu’aux composés organiques. L’échantillon apporté par le gaz vecteur après séparation sur la colonne est brûlé dans une flamme d’hydrogène-air.
Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC)
Composants d'un Système HPLC
- La pompe : elle est munie d'un système de gradient permettant d'effectuer une programmation de la nature du solvant.
- Vanne d'injection : c'est un injecteur à boucles d’échantillonnage. Il existe des boucles de différents volumes, nous utilisons généralement au laboratoire une boucle de 20µl. Le choix du volume de la boucle se fait en fonction de la taille de la colonne et de la concentration supposée des produits à analyser.
- Une colonne est un tube construit dans un matériau le plus possible inerte aux produits chimiques, souvent en inox ou en verre. Sa section est constante, de diamètre compris entre 4 et 20 mm pour des longueurs généralement de 15 à 30 cm.
Phases en HPLC
- La phase normale est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il faut donc utiliser un éluant peu polaire (apolaire).
- La phase inverse est majoritairement composée de silice greffée par des chaînes linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est très peu polaire (apolaire) et nécessite donc un éluant polaire. Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en premier.
Détecteurs en HPLC
- Détecteur UV-visible (voir spectrométrie UV-visible) : il mesure l'absorption de la lumière par le produit à la sortie de la colonne. On opère à longueur d'onde constante, celle-ci ayant été fixée par l'opérateur. La lampe Deutérium est utilisée pour des longueurs d'onde variant de 190-350 nm. Le détecteur à barrette de diodes permet d’obtenir un domaine de longueurs d’onde simultanément. Il fournit en plus du chromatogramme des renseignements spectraux à fin d’assurer l’identité des composés séparés. Ce détecteur est composé d’une rangée de diodes, chacune indiquant l’absorbance moyenne sur un intervalle très étroit de longueur d’onde.
tags: #chromatographie #sur #couche #mince #principe