La chromatographie sur couche mince (CCM) est une technique analytique largement utilisée pour séparer et identifier les composants d'un mélange homogène. Elle repose sur les différences d'affinité des composés entre une phase mobile (l'éluant) et une phase stationnaire (une couche mince d'adsorbant déposée sur une plaque). Cet article explore en détail le principe de la CCM, son fonctionnement, ses applications, et les différents aspects techniques impliqués.
Introduction à la Chromatographie sur Couche Mince
La CCM est une méthode simple, rapide et économique pour séparer les constituants d'un mélange. Elle est particulièrement utile pour :
- Séparer les espèces chimiques (EC) d'un mélange homogène.
- Identifier une ou des EC d'une solution inconnue en comparant l'avancée d'EC connues avec celles de la solution inconnue.
- Contrôler la pureté d'un composé organique.
La CCM est une forme de chromatographie d'adsorption, où la séparation des composés est basée sur la compétition entre leur adsorption sur la phase stationnaire et leur solubilité dans la phase mobile.
Principe de la CCM
Le principe de la CCM repose sur la différence d'affinité des différents composés d'un mélange pour deux phases :
- Phase stationnaire : Une couche mince d'un matériau adsorbant (généralement du gel de silice ou de l'alumine) est déposée sur une plaque de support (aluminium, plastique ou verre). La phase stationnaire est immobile.
- Phase mobile : Un solvant ou un mélange de solvants (l'éluant) qui migre à travers la phase stationnaire par capillarité.
Les composés du mélange sont déposés sur la plaque, puis la plaque est placée dans une cuve contenant l'éluant. L'éluant monte par capillarité, entraînant avec lui les composés du mélange. Les composés ayant une plus grande affinité pour la phase stationnaire se déplacent plus lentement, tandis que ceux ayant une plus grande affinité pour la phase mobile se déplacent plus rapidement. Cette différence de vitesse de migration permet la séparation des composés.
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Protocole Opératoire de la CCM
La réalisation d'une CCM implique plusieurs étapes clés :
Préparation de la cuve et de l'éluant :
- Introduire l'éluant dans la cuve à chromatographie jusqu'à une hauteur d'environ 0,5 cm.
- Fermer la cuve pour saturer l'atmosphère avec les vapeurs de l'éluant. Cela permet d'assurer une migration uniforme de l'éluant.
- Le choix de l'éluant est crucial et dépend des composés à séparer. Il est important d'utiliser un éluant adapté aux composés à séparer.
Préparation de la plaque :
- La plaque chromatographique est généralement constituée d'une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice, fixée à une plaque rigide en aluminium, en plastique ou en verre.
- Tracer un trait au crayon de papier à environ 1,5 cm du bas de la plaque. Ce trait servira de ligne de dépôt. Il est important de ne pas appuyer et de ne pas laisser ses empreintes sur la plaque.
Dépôt des échantillons :
- Si les composés à analyser sont sous forme solide, les dissoudre dans un minimum de solvant.
- Déposer à l'aide d'un capillaire les espèces à séparer, diluées dans un solvant, si possible identique à l'éluant ou suffisamment volatil, au niveau de la ligne de dépôt en réalisant des dépôts séparés de 1 à 2 cm entre eux et du bord de la plaque.
- Il est important de ne pas appuyer le capillaire sur la plaque afin de ne pas la creuser.
- Il est possible de répéter le dépôt plusieurs fois afin d'augmenter la quantité d'espèces chimiques déposées sans élargir les taches.
Développement de la chromatographie :
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- Placer verticalement la plaque dans la cuve, et la refermer rapidement. Au départ, l'éluant ne doit pas toucher les dépôts.
- Attendre, sans bouger la cuve, que l'éluant soit arrivé à environ 1 cm du bord supérieur. L'éluant est entraîné par capillarité vers le haut de la plaque.
Révélation et analyse :
- Retirer la plaque et tracer rapidement au crayon à papier un trait indiquant la hauteur atteinte par l'éluant. C’est le front de solvant.
- Visualiser les taches. Si les composés sont colorés, ils sont directement visibles. Sinon, différentes techniques de révélation peuvent être utilisées (UV, réactifs chimiques).
Révélation des Taches
La visualisation des taches est une étape cruciale de la CCM. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées :
- Observation directe : Si les composés sont colorés, ils sont directement visibles sur la plaque.
- Lumière UV : De nombreux composés absorbent la lumière UV et peuvent être visualisés en exposant la plaque à une lampe UV. On utilise une plaque de silice spéciale imbibée d'un agent qui devient fluorescent sous une radiation de longueur d'onde de 254 nm.
- Réactifs chimiques : Des réactifs chimiques peuvent être pulvérisés sur la plaque pour réagir avec les composés et former des taches colorées.
Le Facteur de Rétention (Rf)
Le facteur de rétention (Rf) est un paramètre important en CCM. Il est défini comme le rapport de la distance parcourue par le composé sur la distance parcourue par le front de solvant :
Rf = (Distance parcourue par le composé) / (Distance parcourue par le front de solvant)
Le Rf est une caractéristique physique d'un composé dans des conditions chromatographiques données. Il peut être utilisé pour identifier les composés en comparant leurs valeurs de Rf avec celles de composés connus.
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Facteurs Influençant la Séparation en CCM
Plusieurs facteurs peuvent influencer la séparation des composés en CCM :
- La nature de la phase stationnaire : Le gel de silice est une phase stationnaire polaire, tandis que l'alumine est une phase stationnaire moins polaire. Le choix de la phase stationnaire dépend de la polarité des composés à séparer.
- La nature de la phase mobile (l'éluant) : La polarité de l'éluant influence la vitesse de migration des composés. Un éluant plus polaire entraînera plus rapidement les composés polaires, tandis qu'un éluant moins polaire entraînera plus rapidement les composés apolaires.
- La température : La température peut affecter la solubilité des composés dans la phase mobile et leur adsorption sur la phase stationnaire.
- L'épaisseur de la couche stationnaire : Une couche stationnaire plus épaisse peut améliorer la séparation des composés.
Applications de la CCM
La CCM est une technique polyvalente avec de nombreuses applications dans différents domaines :
- Chimie organique :
- Suivi de réactions chimiques.
- Contrôle de la pureté des produits.
- Identification de composés inconnus.
- Pharmacie :
- Analyse de médicaments.
- Contrôle de la qualité des produits pharmaceutiques.
- Alimentation :
- Détection de colorants alimentaires.
- Analyse de pesticides.
- Environnement :
- Surveillance de la pollution de l'eau et du sol.
Avantages et Inconvénients de la CCM
La CCM présente plusieurs avantages :
- Simplicité : La technique est facile à mettre en œuvre et ne nécessite pas d'équipement coûteux.
- Rapidité : L'analyse est rapide, généralement quelques minutes à quelques heures.
- Coût : La CCM est une technique économique.
- Polyvalence : Elle peut être utilisée pour séparer une grande variété de composés.
Cependant, la CCM a aussi quelques inconvénients :
- Sensibilité : La sensibilité est limitée par la méthode de révélation utilisée.
- Résolution : La résolution est moins élevée que celle d'autres techniques chromatographiques, comme la chromatographie en phase liquide (HPLC).
- Analyse qualitative : La CCM est principalement une technique qualitative, bien qu'elle puisse être utilisée pour des estimations semi-quantitatives.
CCM et Autres Techniques Chromatographiques
La CCM est souvent comparée à d'autres techniques chromatographiques, telles que la chromatographie en phase liquide (HPLC) et la chromatographie en phase gazeuse (CPG).
- Chromatographie en Phase Liquide (HPLC) : L'HPLC est une technique plus sophistiquée que la CCM, offrant une meilleure résolution et une plus grande sensibilité. Elle est utilisée pour l'analyse quantitative et la séparation de composés complexes. La pompe en HPLC est munie d'un système de gradient permettant d'effectuer une programmation de la nature du solvant. La vanne d'injection en HPLC est un injecteur à boucles d’échantillonnage. Il existe des boucles de différents volumes, avec une utilisation générale au laboratoire d'une boucle de 20µl. Le choix du volume de la boucle se fait en fonction de la taille de la colonne et de la concentration supposée des produits à analyser. Une colonne est un tube construit dans un matériau le plus possible inerte aux produits chimiques, souvent en inox ou en verre. Sa section est constante, de diamètre compris entre 4 et 20 mm pour des longueurs généralement de 15 à 30 cm. La phase dite « normale » en HPLC est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire, nécessitant donc l'utilisation d'un éluant peu polaire (apolaire). La phase inverse en HPLC est majoritairement composée de silice greffée par des chaînes linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est très peu polaire (apolaire) et nécessite donc un éluant polaire. Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en premier. Un détecteur UV-visible (voir spectrométrie UV-visible) mesure l'absorption de la lumière par le produit à la sortie de la colonne. On opère à longueur d'onde constante, celle-ci ayant été fixée par l'opérateur. La lampe Deutérium est utilisée pour des longueurs d'onde variant de 190-350 nm. Le détecteur à barrette de diodes permet d’obtenir un domaine de longueurs d’onde simultanément. Il fournit en plus du chromatogramme des renseignements spectraux à fin d’assurer l’identité des composés séparés. Ce détecteur est composé d’une rangée de diodes, chacune indiquant l’absorbance moyenne sur un intervalle très étroit de longueur d’onde.
- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) : La CPG est utilisée pour séparer et analyser des composés volatils. Le principe de la séparation par CPG consiste à partager l'échantillon à analyser entre deux phases. Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un intégrateur permet d'obtenir un tracé appelé chromatogramme. Le "temps de rétention" (temps au bout duquel un composé est élué de la colonne et détecté), caractérise qualitativement une substance. Deux types de détecteurs sont couramment utilisés : TCD (conductibilité thermique) appelé catharomètre, basé sur la mesure des variations de conductibilité thermique des mélanges gazeux en fonction de leur composition, et FID (détecteur à ionisation de flamme), beaucoup plus sensible que le catharomètre, mais ne donnant de réponse qu’aux composés organiques. L’échantillon apporté par le gaz vecteur après séparation sur la colonne est brûlé dans une flamme d’hydrogène-air.
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