Introduction
La chromatographie sur couche mince (CCM) est une technique analytique largement utilisée pour la séparation et l'identification des composés d'un mélange. Elle repose sur la différence d'affinité des composés entre une phase mobile et une phase stationnaire. Cet article explore les principes de la CCM appliquée aux lipides, en mettant en lumière les différentes étapes, les supports utilisés, les choix d'éluants, et les applications pratiques.
Principes de Base de la Chromatographie d'Adsorption et de la CCM
La chromatographie d'adsorption est une technique de séparation basée sur la différence d'affinité des composés entre une phase mobile et une phase stationnaire. La CCM est une application de cette technique qui utilise une phase stationnaire déposée sur une plaque d'aluminium, de plastique ou de verre. La phase mobile est entraînée par capillarité vers le haut de la plaque.
Phase Stationnaire
La plaque chromatographique est généralement constituée d'une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice fixée à une plaque rigide en aluminium, en plastique ou en verre. Il existe trois principaux types de supports : la silice, l'alumine et la cellulose.
- Silice: C'est le support le plus courant, surtout pour une première approche.
- Alumine: Elle est particulièrement adaptée aux composés à caractère basique.
- Cellulose: Elle est utilisée pour la séparation de composés polaires, comme les sucres ou les acides aminés.
Phase Mobile (Éluant)
Le choix de l'éluant est essentiel et dépend de la polarité des composés à séparer. L'éluant doit être adapté aux composés à séparer. On utilise souvent des mélanges de solvants en proportions variées, comme 100-0, 75-25, 50-50, 25-75, etc.
Déroulement de la CCM
- Préparation de la cuve: On place environ 10 mL d'éluant dans la cuve à chromatographie, afin d'avoir un demi-centimètre d'éluant au fond de celle-ci. La cuve doit être munie d'un couvercle.
- Préparation de la plaque: Tracer au crayon un trait à environ 1,5 cm du bas de la plaque, sans appuyer et sans y laisser ses empreintes. Ce trait servira de ligne de dépôt.
- Dépôt des échantillons: Déposer à l'aide d'un capillaire les espèces à séparer, diluées dans un solvant, si possible identique à l'éluant ou suffisamment volatil, au niveau de la ligne de dépôt en réalisant des dépôts séparés de 1 à 2 cm entre eux et du bord de la plaque. Il est important de ne pas appuyer le capillaire sur la plaque afin de ne pas la creuser. Il est possible de répéter le dépôt plusieurs fois afin d'augmenter la quantité d'espèces chimiques déposées sans élargir les taches.
- Élution: Placer la plaque dans la cuve, en veillant à ce que l'éluant ne recouvre pas les dépôts. Refermer la cuve avec un couvercle pour éviter l'évaporation du solvant et laisser l'éluant diffuser. La vitesse de migration de l'éluant dépend du support et de l'éluant.
- Arrêt de l'élution: Lorsque le front de solvant arrive à deux centimètres du haut de la plaque, on la retire et on repère immédiatement par un trait ce front, afin d'indiquer l'endroit où l'éluant est parvenu.
- Séchage: Laisser sécher la plaque. On peut utiliser une plaque chauffante pour accélérer le processus.
Révélation
La plupart des composés sont incolores et doivent être révélés. Plusieurs méthodes existent :
Lire aussi: Applications de la CCM
- Observation sous UV: Les dérivés aromatiques absorbent dans l'UV. Placer la plaque sous une lampe UV et entourer les taches colorées au crayon. On utilise une plaque de silice spéciale imbibée d'un agent qui devient fluorescent sous une radiation de longueur d'onde de 254 nm.
- Révélation à l'iode: Placer la plaque et quelques cristaux d'iode dans une cuve fermée. Les taches apparaissent en jaune-marron en présence d'iode.
- Pulvérisation de réactifs: On peut utiliser des réactifs spécifiques, comme la ninhydrine en solution (pour les acides aminés, les taches apparaissent en noires) ou le réactif de molybdène en présence de sulfate de cérium. Il est important d'éviter toute formation de gouttelettes et d'appliquer le réactif en plusieurs pulvérisations.
Facteur de Rétention (Rf)
Le facteur de rétention (Rf) est un rapport qui caractérise la migration d'un composé sur un support donné. Il est défini comme le rapport de la distance parcourue par le composé à la distance parcourue par le front de l'éluant.
Rf = (Distance parcourue par le composé) / (Distance parcourue par le front du solvant)CCM des Lipides : Spécificités et Applications
La CCM est particulièrement utile pour l'analyse des lipides en raison de sa capacité à séparer les différents types de lipides en fonction de leur polarité.
Extraction des Lipides
L’objectif de cette méthode est de permettre l’extraction et la transformation des lipides totaux d’un échantillon afin de réaliser une analyse d’acide gras en chromatographie en phase gazeuse. A partir d’un échantillon biologique quelconque (tissu, lysat cellulaire, …), cette méthode permet la séparation et l’extraction des lipides totaux et leur transformation en ester méthylique, afin d’analyser qualitativement et quantitativement la nature des constituants. Les lipides à extraire de l’échantillon doivent être séparés des autres constituants comme les glucides ou les protéines. Pour une séparation simple et rapide, on utilise une des propriétés physicochimiques des lipides : leur hydrophobie. Grâce à l’utilisation de solvants organiques tels que l’hexane, l’isopropanol ou le pentane, mis en contact avec l’échantillon, les lipides vont être extraits des autres constituants par la formation de deux phases.
Afin de pouvoir quantifier la nature des acides gras de l’échantillon, l’utilisation d’un standard interne absent de l’échantillon est nécessaire. L’échantillon en solution (lysat cellulaire, broyat de tissu solubilisé, …) est ajouté dans un tube à méthylation à bouchon fermé. La première étape est l’ajout d’une quantité connue et précise du standard interne. La quantité de standard à ajouter est fonction de la quantité estimée de lipides dans l’échantillon. Puis, 4 mL d’un mélange hexane / isopropanol (3:2 v/v) sont ajoutés. Une homogénéisation est nécessaire afin de bien séparer les constituants dans les phases. La solution est ensuite centrifugée (1100 g, 10 min) et la phase supérieure organique est prélevée et transférée dans un nouveau tube de méthylation. Un lavage est effectué en ajoutant 2 mL de solution NaCl (0,9 %, v/v) puis on centrifuge (3 min, 1100 g) et la phase organique est récoltée. Ensuite, une étape de saponification est réalisée. 1 mL de NaOH 0,5M est ajouté avant la mise au bain-marie à 70°C pendant 20 min des échantillons. L’étape de méthylation passe par l’ajout d’1 mL de Boron trifluoride dans le méthanol (12 %, v/v). Une double extraction est de nouveau réalisée en utilisant 4 mL de NaCl (0,9 %, v/v) additionné de 4 mL de pentane. Les esters méthyliques sont analysés en chromatographie gazeuse, couplée à un spectrophotomètre de masse par exemple2. On obtient un chromatogramme avec lequel on peut identifier et quantifier les acides gras de l’échantillon.
CCM Bidimensionnelle (2D) pour les Lipides
La chromatographie sur couche mince bidimensionnelle (CCM 2D) est une technique avancée qui permet de séparer des lipides complexes en exploitant deux développements successifs avec des solvants différents. Cette méthode est particulièrement utile lorsque les lipides présentent des polarités très similaires et ne peuvent être séparés efficacement par une CCM unidimensionnelle.
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Principe de la CCM 2D
Dans une CCM 2D, l'échantillon est déposé dans un coin de la plaque. Après le premier développement, la plaque est séchée et tournée de 90 degrés. Un deuxième développement est ensuite réalisé avec un solvant différent du premier.
Application à l'étude de la virulence bactérienne
Sur un article d'immuno, ils utilisent une chromato en couche mince à 2D pour séparer des lipides impliqués dans la virulence de bactéries. Là où je voudrais avoir des infos c'est sur le principe de cette TLC en 2D à savoir que sépare la 1ere dimension et que sépare la 2nde . Pour info le solvant de la 1ere D c'est CHCL3:MeOH et toluene:acetone pour la 2eme dimension. En général la chromato papier ça ne sert qu'à faigrer en fonction de la solubilité dans un solvant.
- Première Dimension (CHCL3:MeOH): Le mélange de chloroforme (CHCL3) et de méthanol (MeOH) est couramment utilisé pour séparer les lipides en fonction de leur polarité générale. Le chloroforme est un solvant apolaire qui favorise la migration des lipides neutres, tandis que le méthanol, plus polaire, aide à solubiliser et à séparer les lipides plus polaires comme les phospholipides.
- Deuxième Dimension (Toluene:Acetone): Le mélange de toluène et d'acétone est souvent utilisé pour affiner la séparation en fonction des différences subtiles de structure et de polarité. Le toluène est un solvant apolaire qui permet de séparer les lipides en fonction de leur hydrophobicité, tandis que l'acétone, plus polaire, aide à séparer les lipides en fonction de la présence de groupes fonctionnels polaires.
En combinant ces deux systèmes de solvants, la CCM 2D permet de séparer les lipides de manière plus complète et d'identifier des composés qui seraient autrement difficiles à distinguer.
Applications Pratiques de la CCM des Lipides
- Identification des lipides: La CCM permet d'identifier les lipides en comparant leurs Rf avec ceux de standards connus.
- Analyse de la composition lipidique: Elle permet de déterminer la composition lipidique d'échantillons biologiques, tels que les tissus, les cellules ou les extraits lipidiques.
- Suivi de réactions enzymatiques: La CCM peut être utilisée pour suivre la progression de réactions enzymatiques impliquant des lipides, en analysant les produits formés au cours du temps.
- Contrôle de la pureté des lipides: Elle permet de vérifier la pureté des lipides utilisés comme réactifs ou standards.
Exemples Pratiques
Exemple 1 : Identification de Composés Inconnus
Imagine qu'on te présente un mélange contenant plusieurs composés organiques inconnus et qu'on te demande de déterminer leur identité. Pour ce faire, tu commenceras par préparer la plaque CCM, puis tu appliqueras une petite quantité du mélange inconnu et des composés de référence, tu développeras le chromatogramme et enfin, tu compareras les valeurs Rf des taches produites par le mélange inconnu avec celles des composés de référence connus.
Après l'analyse CCM, les composés du mélange apparaissent sous forme de taches discrètes à des distances variables de la ligne de base, en fonction de la force de leur interaction avec la phase stationnaire par rapport à la phase mobile.
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Une fois les valeurs Rf de ces taches obtenues, tu peux te référer à un tableau de référence contenant les valeurs Rf de composés potentiels déterminés dans des conditions similaires afin de déterminer avec précision l'identité des composants présents dans le mélange.
Exemple 2 : Mesure de la Pureté des Substances
La CCM est un outil efficace pour évaluer la pureté des substances chimiques. En appliquant une petite quantité de la substance à tester sur une plaque CCM et en la développant, tu peux évaluer sa pureté en fonction du nombre de taches observées. Si la substance est pure, tu ne devrais observer qu'une seule tache. La présence de taches supplémentaires indique la présence d'impuretés.
Facteurs Influant sur la Séparation
Plusieurs facteurs peuvent influencer la séparation des lipides par CCM :
- Polarité des solvants: Le choix des solvants est crucial pour obtenir une séparation optimale. Les solvants apolaires favorisent la migration des lipides neutres, tandis que les solvants polaires sont nécessaires pour séparer les lipides plus polaires.
- Type de phase stationnaire: Le type de phase stationnaire (silice, alumine, etc.) influence également la séparation. La silice est souvent utilisée pour les lipides, mais d'autres phases peuvent être plus appropriées pour certains types de lipides.
- Température: La température peut affecter la migration des lipides et la résolution de la séparation.
- Humidité: L'humidité ambiante peut influencer la migration des lipides, en particulier sur les plaques de silice.
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