Introduction
L'ovocyte de xénope, comme celui de nombreux animaux, est bloqué à un stade précis de son développement, plus précisément en prophase de la première division méiotique. Cette pause, qui peut durer des mois voire des années, est cruciale pour assurer la bonne maturation de l'ovocyte et sa capacité à être fécondé. La reprise de la méiose est déclenchée par la progestérone, un signal hormonal qui initie une série d'événements complexes menant à la maturation de l'ovocyte. Cet article explore les mécanismes moléculaires impliqués dans ce blocage et sa levée, en mettant l'accent sur les acteurs clés identifiés grâce à l'étude de l'ovocyte de xénope.
La Maturation Méiotique: Un Processus Clé
La transition entre la prophase I et la métaphase II est appelée maturation méiotique. Ce processus complexe implique une série d'événements coordonnés, notamment la rupture de la vésicule germinative (le noyau de l'ovocyte) et l'activation du complexe p34cdc2/cycline B, également connu sous le nom de MPF (M-phase Promoting Factor). Le MPF est un acteur central de la division cellulaire, et son activation est essentielle pour la reprise de la méiose.
Activation du MPF: Un Mécanisme Délicat
Le mécanisme précis par lequel la progestérone déclenche l'activation du MPF reste complexe. Il est établi que la synthèse de nouvelles protéines, en particulier de la kinase Mos, est nécessaire à cette activation. Le MPF lui-même est capable d'induire, par des mécanismes de rétrocontrôle positif, les événements initialement déclenchés par la progestérone. Pendant la transition entre la métaphase I et la métaphase II, les cyclines sont dégradées et resynthétisées, ce qui entraîne une chute puis une remontée de l'activité du MPF. L'ovocyte subit alors un nouvel arrêt méiotique, cette fois en métaphase II, en attente de la fécondation.
Rôle de la protéine p21CIP1
L'utilisation de l'inhibiteur de CDK, la protéine p21CIP1, a permis de dissocier les événements déclenchés par la progestérone de ceux initiés par rétroaction par le MPF. Les résultats suggèrent que l'accumulation de la cycline B1 est amorcée par la progestérone et pourrait être un événement clé pour l'activation du MPF.
Implication de la kinase Eg2
L'accumulation de Eg2 (une kinase de la famille Aurora/Ipl1) est induite indépendamment du MPF, mais son activation dépend du MPF actif. Eg2 jouerait donc un rôle plutôt en aval de l'activation du MPF, en accord avec ce qui a été décrit concernant le rôle des kinases de cette famille dans le fonctionnement du fuseau mitotique.
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Cibles de p34cdc2 lors de la transition métaphase I-métaphase II
Des études ont porté sur les cibles de p34cdc2 lors de la transition entre la métaphase I et la métaphase II, ainsi que lors du blocage en métaphase II. La micro-injection de p21CIP1 dans des ovocytes à ces stades a révélé que, pendant la transition métaphase I - métaphase II, la synthèse de cyclines B1 et la voie Mos/MAPK sont indépendantes de l'activité de p34cdc2. En revanche, en métaphase II, la dégradation de Mos est induite par l'inactivation du MPF.
L'Ovocyte: Un Modèle d'Étude du Cycle Cellulaire
L'ovocyte s'avère être un système modèle précieux pour l'analyse du déclenchement de la phase M du cycle cellulaire. L'injection de cytoplasme prélevé dans un ovocyte II maturé (bloqué en métaphase II) dans un ovocyte I induit l'entrée en méiose de ce dernier. Cette expérience démontre qu'une substance contenue dans le cytoplasme de l'ovocyte bloqué en métaphase II peut induire la maturation. Ce facteur a été nommé MPF (Maturation Promoting Factor).
Il a été découvert par la suite que le MPF n'est pas seulement le déclencheur de la méiose ovocytaire, mais qu'il déclenche aussi l'entrée en mitose (phase M) des cellules somatiques. En réalité, le cytoplasme injecté contient du MPF "actif" (c'est justement parce que ce MPF est maintenu actif que l'ovocyte est bloqué en métaphase II).
Fusion Cellulaire: Un Outil d'Analyse
La fusion de deux cellules à des stades différents du cycle cellulaire permet d'obtenir un hétérocaryon (cellule contenant deux noyaux différents) avec mise en commun des cytoplasmes. La fusion d'une cellule en mitose et d'une cellule en interphase permet d'observer une condensation des chromosomes issus de la cellule en interphase. Un facteur présent dans la cellule en mitose induit donc visiblement une "entrée en mitose" précoce du noyau de la cellule en interphase. Un facteur diffusible présent dans la cellule en phase M induit l'entrée en mitose (condensation des chromosomes et disparition de l'enveloppe nucléaire) de la cellule en phase G2.
Régulation du Cycle Cellulaire: Les Kinases Cycline-Dépendantes (Cdk)
Les événements et les différentes phases du cycle cellulaire étaient connus depuis longtemps. La remarquable constance de la succession des différentes phases suggérait un contrôle tout au long du cycle, mais les approches biochimiques directes pour mettre en évidence des molécules impliquées dans la régulation ne donnaient aucun résultat.
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Pour assurer, d'une part, l'ordre immuable de la succession des quatre phases du cycle (régulation du cycle), et d'autre part, l'obtention de deux cellules filles rigoureusement identiques (surveillance de l'ADN), la cellule dispose de systèmes de régulation hautement perfectionnés. Dans le premier cas (régulation du cycle), ce sont essentiellement des kinases cycline-dépendantes, les Cdk, qui interviennent.
Les différentes phases du cycle ont lieu selon un ordre immuable et c'est pour assurer le maintien de cette séquence qu'interviennent des Cdk assurant la régulation du cycle cellulaire. Il en existe plusieurs ; elles interviennent tout au long du cycle dans un ordre déterminé : en phase G1 et pour la transition G1-S, c'est-à-dire pour le déclenchement de la réplication de l'ADN, en phase S pour la poursuite de la réplication, en phase G2 et pour la transition G2-M, c'est-à-dire pour le déclenchement de la mitose et pour l'exécution de la mitose.
Identification des Cdk: Un Pas de Géant
Mis en évidence en 1971, le MPF ne sera identifié et caractérisé précisément qu'en 1988. Ce complexe cycline / Cdk agit en déclenchant différentes réactions. Les kinases cycline-dépendantes et autres protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire des cellules de mammifères ont été identifiées grâce aux études effectuées sur la levure (Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe) par une recherche systématique des mutations dans les gènes codant pour des molécules intervenant dans le cycle cellulaire, cdc (cell division cycle). Des souches de mutants cdc thermosensibles ont été utilisées. Toutes les protéines identifiées chez la levure sont des protéines qui ont été conservées au cours de l'évolution et elles existent également chez les mammifères.
Cyclines et Cdk: Un Duo Dynamique
Entre 1987 et 1990, le régulateur universel de l'entrée en mitose (le MPF) est caractérisé : c'est une kinase cycline-dépendante (Cdk) associée à une cycline. Entre 1990 et 2000, une douzaine de Cycline / Cdk sont décrites chez l'homme. Six d'entre elles interviennent dans le contrôle direct du déroulement du cycle cellulaire.
Les cyclines ne sont pas présentes pendant tout le cycle, elles apparaissent puis disparaissent brusquement à des moments précis du cycle, de façon périodique. Les Cdk peuvent donc être sous forme activée ou désactivée, selon qu'elles sont associées ou non à leur cycline.
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Les Cdk sont des sérine-thréonine kinases, enzymes qui catalysent la phosphorylation de protéines cibles (= substrats) jouant un rôle dans les événements du cycle cellulaire (fragmentation de l'enveloppe nucléaire, compaction des chromosomes, réplication de l'ADN…), ou dans l'avancement du cycle. Le cycle cellulaire est contrôlé par au moins 6 complexes Cycline / Cdk différents qui interviennent à des moments précis du cycle cellulaire. Responsable de la transition G1/S.
Régulation Fine de l'Activité des Cdk
Les Cdk sont présentes avant qu'elles ne soient requises. C'est, premièrement, grâce aux cyclines, qui n'ont pas d'activité enzymatique par elles-mêmes, mais se lient aux kinases du cycle pour les rendre actives. C'est, deuxièmement, grâce à des protéines déphosphorylant (Cdc 25) ou phosphorylant (CAK, Wee-1) les Cdk et qui permettent de compléter le contrôle de l'activité des Cdk. D'autre part des acides aminés jouent un rôle particulier suivant qu'ils sont phosphorylés ou non. Pour pouvoir agir, les Cdk doivent présenter une conformation où ces deux poches sont accessibles.
Avant la liaison de la Cdk à la Cycline, le site catalytique de la Cdk est inaccessible pour l'ATP : les boucles PSTAIRE (noms des acides aminés) et T-loop ferment l'entrée du site. La CAK phosphoryle la Thréonine 161 qui se situe au sommet de la boucle T et qui est devenue accessible après la liaison de la cycline à la Cdk. Ceci a pour effet un changement de conformation qui dégage l'entrée du site substrat et permet la fixation du substrat sur la Cdk.
Wee1 phosphoryle la Cdk sur la Thréonine 14 et la Tyrosine 15. Ces phosphorylations provoquent une répulsion électrostatique qui interdit l'entrée de l'ATP dans son site, elles sont donc inhibitrices. Dans ce cas, même si la Cdk est phosphorylée sur Th 161 par la CAK (elle accepte alors le substrat), elle reste inactive car l'ATP ne peut pas prendre sa place. C'est la raison pour laquelle les phosphorylations inhibitrices dominent la phosphorylation activatrice. Quand la p21 se lie à la cycline, elle bloque la poche de l'ATP.
L'activité des complexes Cycline / Cdk peut être inhibée par la phosphorylation de 2 acides aminés (tyrosine 15 et thréonine 14) : la phosphorylation de ces acides aminés se fait par les kinases Wee-1 et Myt 1.
Mécanismes de Surveillance du Cycle Cellulaire
En plus des Cdk, molécules permettant le passage d'une phase à l'autre et l'enchaînement des événements du cycle, existent des mécanismes capables de surveiller des processus très importants du cycle, de détecter des anomalies et d'imposer l'arrêt du cycle si des anomalies sont constatées. Ces mécanismes interviennent lorsque des lésions (DDCP = DNA Damage Checkpoint) ou des anomalies de réplication de l'ADN (RCP = Réplication Checkpoint) sont détectées, ou pour contrôler que les chromatides-sœurs vont bien se répartir équitablement dans les deux cellules filles (MCP = Mitotic Checkpoint).
En effet, cette surveillance assure le maintien de l'intégrité de l'ADN et la qualité de la réplication de l'ADN. Si l'ADN présente des lésions ou si la réplication ne s'effectue pas correctement, le cycle est arrêté pour donner à la cellule le temps de réparer et de terminer correctement la réplication. Un autre aspect du contrôle veille à ce que le partage des chromosomes entre les 2 cellules-filles s'effectue de façon parfaitement équitable au cours de la transition métaphase - anaphase : si tous les chromosomes ne sont pas correctement attachés aux fibres kinétochoriennes, l'anaphase ne débute pas, les deux chromatides-sœurs de chaque chromosome restent liées l'une à l'autre.
Surveillance de l'Intégrité de l'ADN (DDPC)
La surveillance de l'intégrité de l'ADN (DDPC) n'est pas réalisée en un point particulier du cycle mais s'effectue en réalité tout au long de l'interphase (G1, S, G2). Ainsi, lorsqu'une lésion de l'ADN existe, le cycle peut être arrêté soit en G1, (la cellule n'effectue alors pas la transition G1/S), soit en S, soit en G2 (la cellule ne rentre alors pas en mitose).
Surveillance de l'Accomplissement de la Réplication (RCP)
La surveillance de l'accomplissement de la réplication (RCP) ne se fait pas en un point précis du cycle mais s'étale tout au long de la phase S et de la phase G2. Ainsi, la cellule ne pourra pas commencer la mitose tant que la réplication n'est pas correctement terminée et lorsqu'un défaut de réplication est détecté, la cellule arrête le cycle.
Checkpoint Mitotique (MCP)
La surveillance de l'attachement correct des chromosomes métaphasiques au fuseau, ou checkpoint mitotique (MCP), ne s'exerce que dans le court laps de temps de la métaphase et jusqu'à ce que le dernier chromosome ait atteint la plaque métaphasique.
Acteurs Moléculaires des Points de Contrôle
Parmi ces molécules se trouvent des kinases qui se lient à l'ADN, (DNA-PK) : kinase ATM (ataxia-telangiectasia mutée), kinase ATR (ataxia-telangiectasia Related), ainsi que les protéines sérine-thréonine kinases Chk1 et Chk2 (check-point protein kinase). Chez les patients atteints d'ataxia-telangiectasia mutated, la kinase ATM est mutée et les points de contrôle du cycle sont déficients : les cellules continuent à proliférer malgré la présence de coupures dans l'ADN; elles ne s'arrêtent pas en G1, S ou en G2 pour réparer l'ADN.
Si l'ADN est endommagé, la transition G1-S est bloquée par les mécanismes de surveillance de l'état de l'ADN (DDCP). Ces mécanismes aboutissent d'une part à la dégradation de Cdc25A, ce qui arrête le cycle puisque les complexes Cycline D / Cdk4 et Cyclines E, A / Cdk2 ne peuvent plus être activés par Cdc 25A, d'autre part à l'accumulation dans la cellule de p53 qui induit l'expression de p21, inhibiteur des complexes Cyclines E, A / Cdk2.
Dans ce cas, il s'agit pour la cellule de faire en sorte que la mitose ne soit pas déclenchée tant que la réplication n'est pas totalement achevée ou tant que les lésions détectées dans l'ADN qui s'est répliqué ne sont pas réparées. Le maintien de l'arrêt en G2 fait intervenir également la p53, facteur de transcription de la p21 et d'enzymes de réparation de l'ADN. Si l'ADN est lésé, ou si la réplication n'est pas achevée, l'activation de plusieurs voies inhibitrices du complexe Cdk 1 / Cycline B permet d'empêcher l'entrée en mitose.
Le Checkpoint Mitotique en Détail
L'attachement correct des chromosomes au fuseau mitotique en plaque métaphasique est indispensable au déclenchement de l'anaphase. Un mécanisme opère pour s'assurer que tous les chromosomes sont correctement attachés au fuseau avant que la séparation des chromatides-sœurs n'ait lieu. Normalement, à l'anaphase, les chromatides-sœurs se séparent lorsque la séparase (une protéase) détruit par protéolyse spécifique la cohésine qui les maintient rassemblées. Or, tant que les chromosomes métaphasiques ne sont pas correctement attachés au fuseau par leurs kinétochores (et, il suffit qu'un seul ne le soit pas), la séparase est inhibée par la sécurine. Chaque kinétochore non correctement attaché au fuseau envoie un signal inhibiteur bloquant l'activation de APC-Cdc20. Ce signal généré par le kinétochore non attaché correspond à la protéine Mad2 : un seul kinétochore mal attaché a pour conséquence la liaison de Mad2 sur le complexe APC-Cdc20, et ainsi son inhibition.
Transition G2/M et Activation du MPF
L'entrée en mitose, ou transition G2 / M, est sous le contrôle du complexe Cycline B / Cdk1, et se réalise de manière brutale. La Cycline B s'accumule progressivement pendant les phases S et G2, ce qui conduit à une accumulation graduelle du complexe au fur et à mesure que la cellule approche de la mitose. La Cdk1 est alors phosphorylée sur la thréonine 161 par la CAK (Cycline H / Cdk7), mais reste inactive à cause de la phosphorylation de 2 acides aminés voisins (tyrosine 15 et thréonine 14) par la protéine Wee-1. Ainsi, quand la cellule atteint la fin de la phase G2, elle contient un abondant stock de Cycline B / Cdk1 (stock de pré-MPF inactif) prêt à agir mais dont l'activité est réprimée par la présence de 2 groupes phosphate qui bloquent la kinase.
Lorsque la réplication est terminée, la phosphatase Cdc25 n'est plus séquestrée dans le cytoplasme et passe dans le noyau, et en fin de phase G2, la phosphatase Cdc 25 est activée, probablement par phosphorylation par la kinase Polo. Cdc 25 a alors pour action d'enlever les deux phosphates inhibiteurs de Cycline B / Cdk 1. Cdk 1 peut alors phosphoryler Cdc 25 (sur un site différent de celui de la kinase Polo). Cette phosphorylation active Cdc 25 : Cycline B / Cdk 1 active donc son propre activateur (processus d'auto-activation). Selon ce mécanisme, une activation partielle de Cdc 25 par la kinase Polo permet l'activation d'une sous population de complexes Cycline B / Cdk 1 qui, par la suite, phosphoryle plus de Cdc-25 et de Wee-1. Les complexes Cycline B / Cdk 1, une fois activés, permettent l'entrée en mitose.
Effets de l'Activation du MPF
Au début de la mitose, les complexes Cycline B / Cdk1 activés agissent en phosphorylant diverses protéines cibles. La phosphorylation des lamines (filaments intermédiaires du noyau) par la Cycline B / Cdk 1, au début de la mitose, provoque leur dépolymérisation. Or ces lamines étaient associées à l'enveloppe nucléaire et permettaient de la structurer. En conséquence, leur dépolymérisation a pour effet de désorganiser l'enveloppe nucléaire qui se disperse en petites vésicules. Certaines lamines (les lamines B) restent ancrées dans les vésicules d'enveloppe nucléaire, car elles sont isoprénylées (ancre lipidique). Les lamines ont des séquences de liaison aux chromosomes, ce qui facilite la reformation de l'enveloppe nucléaire autour de ceux-ci en fin de mitose.
L'activation massive et irréversible du complexe Cycline B / Cdk1 permet l'entrée en mitose.
ARPP19: Un Acteur Clé dans le Blocage de l'Ovocyte
Des recherches récentes ont mis en évidence le rôle central d'une protéine appelée ARPP19 dans le blocage du cycle de différenciation des ovocytes. Selon son état de phosphorylation, ARPP19 bloque la division des cellules, ou au contraire, l'induit.
Lorsqu'elle est phosphorylée par PKA, elle interrompt le cycle. Puis, en réponse au signal hormonal de l'ovulation, c'est une autre protéine kinase appelée Greatwall qui à son tour, phosphoryle ARPP19 sur un autre site. Ces travaux dévoilent donc une réaction-clé qui contrôle la maturation des ovocytes et donc la reproduction sexuée.
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