Découvrez le Protocole Révolutionnaire du Marquage FGF8 pour Comprendre le Développement Embryonnaire de la Souris !

Introduction

Le développement embryonnaire est un processus complexe et finement orchestré, impliquant une cascade d'événements moléculaires et cellulaires. Parmi les nombreux facteurs de signalisation impliqués, le facteur de croissance des fibroblastes 8 (FGF8) joue un rôle crucial, notamment dans le développement de structures clés telles que le cerveau et les yeux. Cet article explore l'importance du marquage FGF8 dans l'étude du développement embryonnaire de la souris, en mettant en lumière un protocole essentiel pour comprendre les mécanismes fondamentaux de la morphogenèse.

Développement de l'Oeil : Un Exemple de la Complexité du Développement Embryonnaire

Le développement de l'œil chez les embryons d'oiseaux illustre bien la complexité du développement embryonnaire. Les yeux, qui atteignent rapidement leur taille définitive, sont des organes sensoriels essentiels à la perception de la lumière. La construction des yeux varie considérablement entre les espèces, bien que des convergences évolutives puissent mener à des structures similaires chez les vertébrés et les céphalopodes.

Les cellules photoréceptrices se différencient à partir du système nerveux central (neurectoderme) chez les vertébrés, tandis que les yeux des céphalopodes et des arthropodes se différencient à partir de l'épiderme (ectoderme non-neural). De plus, la rétine est organisée différemment chez les vertébrés et les céphalopodes. Tous ces types d'yeux dépendent d'un programme génétique qui est en partie commun, activé par le facteur de transcription Pax6.

Des mutations perte-de-fonction de PAX6 et de ses orthologues aboutissent à des yeux malformés ou absents. L'expression du Pax6 de souris par transgénèse dans la drosophile aboutit à la formation d'un oeil ectopique, mais un oeil composé de drosophile, pas un oeil de souris. Cependant, des yeux d'un type particulier dans des taxons éloignés comme les yeux à chambre des Vertébrés et des Céphalopodes ne sont pas homologues car ils ne sont pas hérités d'un ancêtre commun.

Le développement de l'œil humain commence à 3 semaines et se poursuit jusqu'au 5ème mois postnatal. Cela commence par l'expression d'un ensemble de facteurs de transcription dans la partie de la plaque neuroectodermique nommée champ oculaire. Parmi ces facteurs de transcription, Six3 et Rax jouent des rôles particulièrement notables. Six3 peut induire à lui tout seul une cupule optique dans le mésencéphale de manière ectopique.

La signalisation en provenance du mésoderme pré-chordal et notamment SHH divise le champ oculaire unique en une moitié droite et une moitié gauche. L'inhibition de l'expression de Pax6 dans la ligne médiane contribue à séparer le champ en deux. Ensuite, se forment deux vésicules optiques autour de la 4ème semaine du développement humain. La région distale de la vésicule optique s'invagine pour former une structure en forme de coupe, la coupe ou cupule optique.

Les vésicules optiques se rapprochent de l'épiderme qui s'épaissit en formant les placodes optiques ou placodes du cristallin. Les cellules de ces placodes s'invaginent et se détachent de l'épiderme restant qui forme la cornée (fin de l'invagination lors de la 5ème semaine de développement chez l'Humain). Pendant ce temps, les vésicules optiques se replient formant la rétine neurale et l'épithélium pigmenté rétinien. La pigmentation de cet épithélium commence à la fin de la 5ème semaine. La rétine et l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) sont formés respectivement à partir des parois externe et interne de la vésicule optique et commencent à exprimer des facteurs de détermination différents : Vsx2 (ancien nom Chx10) pour la rétine et Mitf pour le RPE. La partie non neurale de l'oeil est formée à partir de l'ectoderme sus-jacent aboutissant à la cornée et au cristallin.

La vésicule optique qui est une expansion du prosencéphale (cerveau antérieur) envoie des signaux inducteurs vers l'épiderme de la placode du cristallin : BMP4, FGF8 et Delta. L'épiderme avait déjà été rendu compétent à ces signaux au préalable. La placode du cristallin envoie en retour des FGF qui activent la formation de la coupe optique, laquelle envoie en retour d'autres FGF qui provoquent l'invagination de la placode.

La signalisation FGF est nécessaire pour la formation de la placode du cristallin. La déplétion génétique des deux récepteurs Fgfr1/2, induit par la Cre recombinase, conduit à une placode cristalline plus fine, et les marqueurs du cristallin, Prox1 et αA-cristalline, sont absents, indiquant un défaut de développement important après le stade d'induction du cristallin. Les FGF envoyés par la placode du cristallin sont indispensables pour activer l'expression de Vsx2 dans la future rétine. Le mésenchyme céphalique intervient également en envoyant des signaux (notamment TGFβ) qui activent l'expression de Mitf dans le futur épithélium pigmenté rétinien (RPE) et y inhibent l'expression de Vsx2.

L'invagination de la rétine est cruciale pour la formation de la coupe optique. Des études sur des coupes optiques auto-organisées à partir de cellules souches embryonnaires humaines ont suggéré que leur formation est un processus spontané qui consiste en trois processus locaux consécutifs : relaxation de la rétine, constriction apicale de la région charnière et expansion tangentielle. Adjacente à la région charnière où se produit l'invagination de la rétine se trouve la zone marginale ciliaire (CMZ), qui sert de pool de cellules souches pour la neurogenèse rétinienne pendant le développement et éventuellement la régénération de l'œil des vertébrés.

La signalisation SCF/SCFR régule la dynamique du cytosquelette et la constriction apicale dans la CMZ. Un protocole est appliqué sur des cellules ES humaines pour leur faire former en 24 jours des coupes optiques. Ces coupes sont incubées dans un milieu contrôle ou supplémenté en SCF ou avec l'inhibiteur du récepteur SCFR, isck03. Le traitement SCF a augmenté l'activité de pMLC dans le CMZ pendant l'invagination tandis que isck03 a diminué l'activité de pMLC. L'administration de SCF et d'isck03 n'a pas modifié la polarité de la neurorétine (ni centrale, ni dans la CMZ).

La rétine des vertébrés est composée de cinq grands types de cellules neuronales et de trois types de cellules gliales qui sont organisés en trois couches différentes. Il existe deux grands types de photorécepteurs : les cones et les batonnets qui diffèrent par leur sensibilité, leurs molécules photoréceptrices et leur distribution spatiale dans la rétine. Les cellules horizontales, bipolaires et amacrine traitent et intègrent les informations reçues par les photorécepteurs avant de transmettre l'information aux cellules ganglionnaires qui projettent leur axone dans ce qui forme le nerf optique. Initialement, la rétine n'est formée que d'une couche cellulaire externe (dite zone nucléaire) et une couche acellulaire interne.

L'analyse UMAP permet de représenter des données dans un espace virtuel où chaque élément est placé à proximité des éléments le plus similaires et placé de manière très éloignée des éléments les plus différents. On observe les groupes (ou clusters) de cellules correspondant à des différenciations particulières en plus de progéniteurs rétiniens multipotents (RPC). L'émergence de développement et de sous-types de photorécepteurs a été déterminée par détection avec le marqueur précurseur du photorécepteur CRX, le marqueur pan photorécepteur recoverine, les marqueurs photorécepteurs coniques opsin bleu et opsin rouge / vert, et le marqueur précurseur de photorécepteur en bâtonnet NRL. Les RPC progressent à travers des états de compétence.

Importance du Marquage FGF8

FGF8 est un facteur de signalisation sécrété qui joue un rôle essentiel dans de nombreux aspects du développement embryonnaire, notamment :

Développement du cerveau antérieur : FGF8 est exprimé dans le centre organisateur isthmique (IsO) et est crucial pour la régionalisation et la croissance du cerveau antérieur.
Développement des membres : FGF8 est impliqué dans l'initiation et la croissance des bourgeons des membres.
Développement de l'oreille interne : FGF8 régule la formation et la différenciation des structures de l'oreille interne.
Développement de l'oeil: FGF8 est impliqué dans l'induction du cristallin par le vésicule optique.

Le marquage FGF8 permet de visualiser et de localiser l'expression de ce facteur de signalisation dans l'embryon en développement. Cela permet aux chercheurs de :

Identifier les régions où FGF8 est actif : En utilisant des techniques d'immunohistochimie ou d'hybridation in situ, on peut déterminer précisément les cellules et les tissus qui expriment FGF8.
Etudier les effets de FGF8 sur les cellules cibles : En combinant le marquage FGF8 avec d'autres marqueurs cellulaires, on peut analyser comment FGF8 influence la prolifération, la différenciation et la migration des cellules cibles.
Déterminer les mécanismes de régulation de l'expression de FGF8 : En étudiant les facteurs qui contrôlent l'expression de FGF8, on peut mieux comprendre comment ce facteur de signalisation est impliqué dans les réseaux de régulation génique qui contrôlent le développement embryonnaire.

Protocole de Marquage FGF8 chez l'Embryon de Souris

Il existe plusieurs protocoles de marquage FGF8 chez l'embryon de souris, chacun ayant ses avantages et ses inconvénients. Le choix du protocole dépend des objectifs de l'étude et des ressources disponibles. Voici un protocole général qui peut être adapté en fonction des besoins spécifiques :

1. Préparation des Embryons

Collecte des embryons : Les embryons de souris sont collectés à différents stades de développement, en fonction de l'aspect du développement que l'on souhaite étudier. La date de gestation est déterminée en considérant le jour de la présence d'un bouchon vaginal comme le jour 0.5 de gestation (E0.5).
Fixation : Les embryons sont fixés dans une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4% pendant une durée variable (généralement de quelques heures à une nuit), afin de préserver leur morphologie et de stabiliser les protéines.
Déshydratation et inclusion : Les embryons sont ensuite déshydratés dans une série de bains d'éthanol de concentration croissante, puis inclus dans de la paraffine. Cette étape permet de réaliser des coupes fines des embryons.

2. Coupe et Montage des Tissus

Coupe : Les blocs de paraffine contenant les embryons sont coupés à l'aide d'un microtome, afin d'obtenir des coupes fines (généralement de 5 à 10 µm d'épaisseur).
Montage : Les coupes sont montées sur des lames de verre, puis déparaffinées et réhydratées avant de procéder au marquage.

3. Marquage Immunohistochimique

Blocage des sites non spécifiques : Les lames sont incubées dans une solution de blocage (généralement du sérum de l'espèce dans laquelle l'anticorps secondaire a été produit) afin de réduire la liaison non spécifique des anticorps.
Incubation avec l'anticorps primaire : Les lames sont incubées avec un anticorps primaire spécifique de FGF8. La concentration de l'anticorps et la durée d'incubation doivent être optimisées en fonction de l'anticorps utilisé et du stade de développement de l'embryon.
Incubation avec l'anticorps secondaire : Après avoir lavé les lames pour éliminer l'anticorps primaire non lié, les lames sont incubées avec un anticorps secondaire couplé à une enzyme (comme la peroxydase de raifort, HRP) ou à un fluorophore. L'anticorps secondaire se lie à l'anticorps primaire.
Détection : Si l'anticorps secondaire est couplé à une enzyme, un substrat spécifique est ajouté pour produire un signal coloré ou fluorescent. Si l'anticorps secondaire est couplé à un fluorophore, les lames sont observées directement au microscope à fluorescence.
Contre-coloration (optionnelle) : Une contre-coloration peut être utilisée pour visualiser les noyaux des cellules (par exemple, avec du DAPI) ou d'autres structures tissulaires.
Montage final : Les lames sont montées avec un milieu de montage approprié et observées au microscope.

4. Marquage par Hybridation In Situ

Le marquage par hybridation in situ (ISH) est une autre technique couramment utilisée pour détecter l'expression de FGF8. Cette technique consiste à utiliser une sonde d'ARN complémentaire à l'ARN messager (ARNm) de FGF8. La sonde est marquée avec une molécule détectable (par exemple, la digoxigénine) et hybridée aux coupes de tissu. Après avoir éliminé la sonde non liée, un anticorps anti-digoxigénine couplé à une enzyme est utilisé pour visualiser le signal.

5. Analyse et Interprétation des Résultats

Les résultats du marquage FGF8 doivent être analysés et interprétés avec soin. Il est important de :

Utiliser des contrôles appropriés : Des contrôles positifs (tissus connus pour exprimer FGF8) et des contrôles négatifs (absence d'anticorps primaire ou de sonde) doivent être inclus pour vérifier la spécificité du marquage.
Comparer les résultats avec des données de la littérature : Les résultats obtenus doivent être comparés avec les données de la littérature concernant l'expression de FGF8 dans l'embryon de souris.
Tenir compte de la variabilité biologique : L'expression de FGF8 peut varier légèrement d'un embryon à l'autre. Il est donc important d'analyser un nombre suffisant d'embryons pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Développement du Cortex Cérébral : Un Exemple de l'Importance de FGF8

Le néocortex cérébral se développe dans la zone la plus superficielle dorsale du télencéphale des mammifères. Le télencéphale est l'une des 5 vésicules céphaliques des Vertébrés et c'est la plus antérieure. Le néocortex est constitué de deux classes principales de neurones : les neurones glutamatergiques (excitateurs) et les interneurones GABAergiques (inhibiteurs). Les neurones glutamatergiques excitateurs représentent 70 à 80 % des neurones qui peuplent le néocortex humain. La plupart d'entre eux sont des neurones pyramidaux, caractérisés par leur morphologie. Les interneurones inhibiteurs GABAergiques, qui n'envoient généralement que des projections axonales locales, constituent environ 25 % des neurones du cortex humain et sont subdivisés en de nombreux types. Ces interneurones ne sont pas générés sur place, contrairement aux neurones excitateurs. Enfin, le néocortex est morcelé en de nombreuses aires corticales, chacune spécialisée dans des fonctions spécifiques, liées à leur connectivité entre elles et avec le reste du cerveau.

Les neurones sont générés à partir de cellules souches neuronales qui sont en fait des cellules de la glie radiaire qualifiée de apicale (aRG) car leur prolongement est en contact avec la partie apicale du neuroépithélium. Ces cellules souches peuvent subir une division symétrique qui génère deux cellules souches (expansion) ou une division asymétrique où l'une des cellules reste cellule souche (auto-renouvellement) et l'autre devient un précurseur qui peut proliférer mais qui finira par se différencier (en neurone ou en cellule gliale).

Les cellules de la glie radiaire ont un cil primaire qui baigne dans le liquide céphalo-rachidien. Des études de protéomique ont montré que ce liquide a une composition qui varie au cours du temps : il est d'abord enrichi en Sonic Hedgehog (à partir de E10,5 chez la souris) puis sa concentration diminue tandis que la concentration en acide rétinoïque augmente (vers E14,5).

La suractivation de la voie Shh aboutit à une augmentation de 8 fois du nombre de colonies de neurosphères primaires par cellule ensemencée par rapport aux témoins de la même portée. Cependant la voie Notch doit concomitamment être fonctionnelle.

La signalisation purinergique via les récepteurs métabotropiques P2Y1 initie des augmentations de concentration calcique transitoires qui se propagent à travers les cellules de la VZ grâce à des jonctions gap. IP3 est nécessaire au déclenchement de ces augmentations. Les cils primaires des RGC font saillie dans les ventricules, où ils sont exposés à des facteurs de croissance diffusibles dans le liquide céphalo-rachidien. Ces facteurs initient des augmentations de concentration en Ca2+ et influencent également la division des RGC. Enfin, la dépolarisation médiée par le GABA et le glutamate agissant respectivement sur les GABAR et les AMPAR, contrôle la prolifération en induisant des augmentations de concentration calcique via les VGCC (canaux calciques voltage-dépendants).

Les 6 couches sont générées de manière inversée. Les neurones les plus précoces occupent les couches les plus profondes et les derniers neurones produits occupent les couches les plus superficielles. Les neurones se développent par vagues de neurogenèse, migration radiale et différenciation à partir des progéniteurs gliaux radiaux de la zone ventriculaire et des cellules progénitrices intermédiaires de la zone sous-ventriculaire.

Les études de suivi de cohortes de prolifération marqués à des temps différents démontrent le schéma intérieur-extérieur du développement cortical cérébral. Des rats femelles gestantes reçoivent des injections de thymidine tritiée (3H) à des stades de plus en plus avancés de la gestation (E11, E13, E15). La thymidine tritiée s'incorpore dans l'ADN des cellules qui sont en réplication à ce moment-là. Lorsque les petits sont nés, on leur permet de survivre jusqu'à la maturité, puis leurs cerveaux sont traités pour révéler les cellules marquées. Les neurones qui sont issus de la prolifération à E11 se trouvent principalement dans la sous-plaque (la matière blanche sous-corticale), tandis que les neurones issus de la prolifération au jour E13 se trouvent dans les couches corticales profondes, c'est-à-dire les couches V et VI. Les neurones issus de prolifération au jour E15 se trouvent dans les couches corticales plus superficielles, c'est-à-dire IV, III et II. La vitesse de prolifération des cellules souches et des précurseurs tend à ralentir au cours du temps durant le développement du cortex.

L'absence d'un inhibiteur de CDK aboutit à des couches corticales plus épaisses. Des régulations traductionnelles ont lieu comme le montre le rôle joué par le microARN miR-449a dans l'arrêt de la prolifération des précurseurs neuronaux. En perte-de-fonction de miR-449a il y a une stimulation de la prolifération mais aussi de l'apoptose (qui est induite par une prolifération prolongée excessive). Durant tout le processus, le maintien des cellules souches neurales est crucial. Les progéniteurs neurogéniques intermédiaires expriment Delta-like 1 (Dll1) et activent la voie Notch dans les cellules souches ce qui inhibe leur différenciation et les maintient dans un état de cellule souche.

Les cellules gliales radiaires apicales (aRG) ont un processus apical qui atteint la surface ventriculaire, où elles exposent leur cil primaire au liquide céphalo-rachidien et ont un processus basal qui atteint la surface corticale. Les cellules gliales radiaires basales (bRG) ont leurs corps cellulaires situés dans des zones plus basales de la paroi corticale. Les processus apicaux et basaux de ces cellules établissent un échafaudage à travers toute la paroi corticale. Les RG subissent une division cellulaire, donnant naissance à une cellule fille qui peut être soit une autre RG (division apicale ou basale - symétrique), soit un progéniteur basal (division asymétrique, les progéniteurs intermédiaires sont représentés en orange). Ces cellules donnent naissance à des neuroblastes migrateurs qui se déplacent le long des processus basaux des RG pour atteindre leur position finale dans les couches corticales. Les neurones des couches profondes sont d'abord générés, puis les neurones des couches supérieures voient le jour.

Les neurones changent séquentiellement leurs modes de migration. Tout d'abord, dans la zone d'accumulation de précurseurs (MAZ), ils ont une migration multipolaire, où ils étendent et rétractent plusieurs protrusions de manière dynamique. Les cellules multipolaires prennent ensuite une morphologie bipolaire via l'activation de la N-cadhérine. La régulation du cytosquelette d'actine médiée par la N-cofiline est ensuite impliquée dans la migration radiaire des neurones dans la zone intermédiaire (IZ) puis dans la plaque corticale (CP) en utilisant les fibres gliales radiaires comme échafaudage. Enfin, lorsqu'ils arrivent dans la région la plus externe de la CP, les neurones passent en mode de translocation terminale, dans lequel les corps cellulaires se déplacent rapidement de manière indépendante des fibres gliales radiaires pour terminer leur migration.

La migration radiale des nouveaux neurones est réalisée par la succession de plusieurs cycles de formation d'une protrusion frontale suivie par une nucléokinèse, c'est-à-dire le déplacement du noyau à l'intérieur du cytoplasme. Des protéines contrôlant le cytosquelette tels que les petites GTPases Rho, Rac et Cdc42 sont importantes pour la migration radiale des nouveaux neurones (qu'ils soient excitateurs ou inhibiteurs). En absence d'ARHGAP15, les futurs neurones ont une migration qui n'est pas seulement radiale mais multidirectionnelle ce qui les amène à des destinations anormales.

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Marquage FGF8 et Développement Embryonnaire de la Souris : Un Protocole Essentiel