Introduction
L'acétate de myristate de phorbol (PMA) et l'ionomycine sont deux composés chimiques fréquemment utilisés ensemble dans la recherche immunologique pour stimuler les cellules immunitaires, en particulier les lymphocytes T. Cependant, il est crucial de comprendre leurs mécanismes d'action, leurs effets combinés et les limites de leur utilisation pour interpréter correctement les résultats expérimentaux. Cet article explore les applications de ces composés, en particulier dans le contexte de l'étude de la réponse immunitaire porcine, tout en soulignant les limites associées à leur utilisation.
Mécanismes d'action du PMA et de l'ionomycine
Le PMA est un ester de phorbol qui active la protéine kinase C (PKC), une enzyme clé dans les voies de signalisation cellulaire. L'ionomycine, quant à elle, est un ionophore calcique qui augmente la concentration intracellulaire de calcium. Ensemble, ils simulent l'activation des lymphocytes T en contournant les récepteurs d'antigènes et les molécules de costimulation. Cette activation induit l'expression de gènes impliqués dans la réponse immunitaire, tels que les cytokines.
Dans l'exemple fourni, l'ionomycine et le PMA agissent conjointement pour stimuler l'expression des gènes dépendant du NFAT. Cependant, une concentration plus élevée d'ionomycine entraîne une diminution de l'expression, ce qui souligne l'importance d'optimiser les concentrations de ces composés pour obtenir l'effet désiré.
Applications dans l'étude de la réponse immunitaire porcine
Plusieurs outils ont été développés pour analyser les effets des mycotoxines chez le porc, notamment :
- PCR quantitative et puce ADN : pour analyser l'expression des gènes de la réponse immunitaire.
- Explants intestinaux : pour étudier l'effet des mycotoxines sur l'intestin.
- Intoxications expérimentales : pour évaluer les effets systémiques des mycotoxines.
- Mise en culture et isolement de différents types cellulaires porcins : pour étudier les mécanismes d'action des mycotoxines au niveau cellulaire.
PCR quantitative
La PCR quantitative (qPCR) est une technique largement utilisée pour quantifier l'expression des gènes. Elle combine l'amplification de l'ADN avec la détection immédiate des produits. Dans le contexte de l'étude de la réponse immunitaire porcine, la qPCR est utilisée pour quantifier la quantité initiale d'ARNm cible présente dans des échantillons obtenus à partir de tissus ou de cellules exposés aux toxines. L'approche qPCR utilise le SYBR®Green pour quantifier l'ARNm cible. Les gènes liés au système immunitaire, tels que les cytokines et les gènes de régulation, ou les gènes liés à la structure de l'intestin sont ciblés. Environ 60 jeux d'amorces ont été validés pour l'étude de l'expression des gènes ou des cellules immunitaires intestinales. Cette technologie a été appliquée pour évaluer l'effet de l'exposition aux mycotoxines des cellules immunitaires ou de l'intestin, ainsi que les effets des additifs alimentaires.
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Puce ADN spécifique pour la réponse immunitaire du porc
Une puce à ADN spécifique pour la réponse immunitaire du porc a été développée en collaboration avec C. Rogel-Gaillard (INRA, UMR GABI, Jouy-en Josas). Cette puce combine un ensemble générique de 13297 sondes avec de nouvelles sondes ciblées sur la réponse immunitaire et le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). Cet ensemble comprend 3773 sondes, qui visent tous les loci annotés du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) ainsi que des gènes de l'immunité en dehors de ce complexe. Cette puce ADN a été validée par l'étude de la réponse immunitaire des cellules mononucléées du porc issues du sang périphérique stimulées par le lipopolysaccharide (LPS) ou un mélange d'acétate myristate de phorbol (PMA) et de l'ionomycine (Gao et al., 2010). Elle est actuellement utilisée pour étudier l'effet des mycotoxines sur la réponse immunitaire chez le porc.
Explants intestinaux
Les explants intestinaux représentent un modèle intéressant dans le contexte de la réduction du nombre d'animaux de laboratoire (principes des 3R). La culture des explants intestinaux permet de préserver la structure histologique normale in vitro. En outre, un grand nombre d'explants peuvent être préparés à partir d'un seul animal, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaire pour une étude donnée. Un modèle d'explants jéjunaux a été développé et utilisé pour étudier l'effet des mycotoxines sur l'intestin de porc (Kolf-Clauw et al., 2009).
Intoxications expérimentales
Des expériences in vivo peuvent être effectuées sur des porcelets (maximum 40). Des intoxications expérimentales sont effectuées, soit en utilisant des aliments contaminés artificiellement ou naturellement, soit en gavant les animaux. Selon l'objectif des études, des expositions à court et à long terme (de 1 semaine à 7 semaines) peuvent être envisagées. Les études sont principalement axées sur les effets des mycotoxines au niveau systémique en utilisant des échantillons de sang prélevés à la veine jugulaire. Des échantillons d'organes, en particulier des échantillons intestinaux, sont également utilisés. Ces échantillons, prélevés lors de l’abatage sont immédiatement congelés dans l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à leur traitement, ou préservés dans le formol. Les paramètres systémiques mesurés comprennent les paramètres généraux toxicologiques (performance, hématologie/biochimie, histologie), ainsi que les paramètres spécifiques décrivant les réactions du système immunitaire. Une attention particulière est portée sur l'impact des mycotoxines sur la réponse immunitaire spécifique suite à un challenge antigénique. En effet, la vaccination ou les modèles pathogènes ont déjà été utilisés pour évaluer les effets sur la mise en place de la réponse spécifique, humorale et cellulaire. Les paramètres intestinaux englobent une analyse histopathologique (immunohistochimie, histologie, les mesures de la crypte et les villosités), évaluation de la perméabilité intestinale (protéines de jonction, voies de signalisation cellulaire) et l'analyse de l'immunité intestinale (colonisation des bactéries, expression des cytokines).
Culture cellulaire
Dans le but d'identifier le mode d'action des mycotoxines, des techniques ont été développées pour isoler et/ou différencier des cellules porcines. L'isolement de cellules sanguines, comme les lymphocytes, les neutrophiles ou les monocytes est maîtrisé. Des travaux sont également menés sur les macrophages alvéolaires porcins et les cellules dendritiques. Pour les cellules épithéliales intestinales, la lignée porcine de cellules épithéliales intestinales IPEC-1 est utilisée. Cette lignée cellulaire est capable de se différencier lorsqu'elle est cultivée sur les semi-filtre poreux.
Limites de l'utilisation du PMA et de l'ionomycine
Bien que le PMA et l'ionomycine soient des outils utiles pour stimuler les cellules immunitaires, il est important de reconnaître leurs limites :
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Activation non physiologique : L'activation induite par le PMA et l'ionomycine ne reproduit pas fidèlement l'activation physiologique des cellules immunitaires par les antigènes. Elle contourne les récepteurs d'antigènes et les molécules de costimulation, ce qui peut entraîner une activation non spécifique et des résultats difficiles à interpréter.
Effets secondaires : Le PMA et l'ionomycine peuvent avoir des effets secondaires sur les cellules, tels que la cytotoxicité et l'altération de l'expression génique. Il est donc important d'utiliser ces composés avec précaution et d'optimiser les concentrations pour minimiser les effets indésirables.
Variabilité : La réponse des cellules au PMA et à l'ionomycine peut varier en fonction du type cellulaire, de l'état d'activation et des conditions expérimentales. Il est donc important de contrôler ces facteurs pour obtenir des résultats reproductibles.
Pertinence in vivo limitée : Les résultats obtenus in vitro avec le PMA et l'ionomycine ne sont pas toujours transposables in vivo. Il est donc important de valider les résultats in vitro avec des modèles in vivo.
Manque de réactifs pour l'analyse des protéines porcines : La principale limite à l'étude de l'expression des gènes dans l'espèce porcine est le manque de réactifs pour l'analyse des protéines. Les connaissances sur le génome porcin permettent de concevoir des amorces pour l'étude de l'expression des ARNm.
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Alternatives au PMA et à l'ionomycine
Pour pallier les limites du PMA et de l'ionomycine, il est possible d'utiliser d'autres méthodes de stimulation des cellules immunitaires, telles que :
Antigènes spécifiques : L'utilisation d'antigènes spécifiques permet d'activer les cellules immunitaires de manière plus physiologique et spécifique.
Anticorps anti-CD3 et anti-CD28 : Ces anticorps se lient aux récepteurs CD3 et CD28 des lymphocytes T et simulent l'activation par les antigènes et les molécules de costimulation.
Cytokines : L'ajout de cytokines peut stimuler la prolifération et la différenciation des cellules immunitaires.
Cellules présentatrices d'antigènes (CPA) : La co-culture de cellules immunitaires avec des CPA permet de simuler l'activation physiologique des cellules immunitaires.
Les cellules MAIT et leur stimulation par PMA-Ionomycine
Les cellules MAIT (Mucosal-Associated Invariant T) sont des lymphocytes T innés qui présentent un répertoire de récepteurs à l’antigène restreint. Elles sont sélectionnées par MR1, une molécule du CMH de classe I non classique très conservée. Ces cellules ont des capacités particulières telles que leur localisation tissulaire, la taille clonale élevée et des capacités effectrices immédiates.
Les cellules MAIT CD8-CD4- et CD8+ sont capables de sécréter de l’IFNγ, du TNFα après stimulation par des billes recouvertes d’anticorps anti-CD3 et anti-CD28 ou par des cellules présentatrices d’antigènes infectées par des bactéries. Cependant, elles sécrètent également de l’IL-2 et de l’IL-17 après stimulation par la PMA-Ionomycine. Les cellules MAIT expriment également la granulysine et la perforine et dégranulent après stimulation par la PMA-Ionomycine. Par conséquent, les cellules MAIT présentent des capacités cytotoxiques, en induisant la lyse de cellules cibles infectées par des bactéries (monocytes, HELA-MR1 et HT10-80-MR1). Ainsi les cellules MAIT présentent différentes capacités fonctionnelles qui pourraient dépendre du type de cellules présentatrices d’antigène, de la nature et de l’intensité de la costimulation. Ces capacités pourraient leur permettre de jouer différents rôles dans l’immunité des muqueuses.
Les cellules NK et leur régulation
Les cellules NK (Natural Killer) jouent un rôle important dans la réponse immunitaire innée. Elles sont capables de tuer des cellules tumorales tout en épargnant les cellules saines du soi. Elles produisent également des cytokines pro-inflammatoires, telles que l’interféron gamma (IFN-γ), qui participe à l’orientation de la réponse immunitaire adaptative. En interagissant avec les cellules dendritiques dans les ganglions lymphatiques, les cellules NK contribuent à façonner la réponse adaptative exercée par les lymphocytes T (LT) et B (LB). En tuant des cellules infectées et stressées, les cellules NK participent aussi au développement de la réponse adaptative en fournissant des débris cellulaires qui peuvent être cross-présentés aux LT CD8+ cytotoxiques.
La réactivité des cellules NK est régulée par un équilibre entre les signaux inhibiteurs et activateurs. Les récepteurs inhibiteurs reconnaissent les molécules du CMH-I présentes à la surface des cellules saines, ce qui empêche l'activation des cellules NK. En revanche, les récepteurs activateurs reconnaissent les ligands exprimés par les cellules tumorales ou infectées, ce qui déclenche l'activation des cellules NK et la lyse des cellules cibles. La calibration de la réactivité des cellules NK n’est cependant pas uniquement dépendante des signaux délivrés par l’engagement des récepteurs inhibiteurs lors de la reconnaissance des molécules de CMH-I. La réactivité des cellules NK peut être aussi modulée par les récepteurs activateurs au cours de leur éducation.
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