La fécondation, un processus fondamental pour la reproduction sexuée, correspond à la rencontre et à la fusion du gamète mâle (spermatozoïde) et du gamète femelle (ovocyte). Chez les mammifères, cette union complexe déclenche une série d'événements biochimiques et cellulaires précis, conduisant à la formation d'un zygote, la première cellule d'un nouvel individu.
Diversité de la Fécondation
La fécondation est externe chez les anoures tels que le xénope, avec néanmoins un accouplement qui s’appelle un amplexus. Le mâle maintient la femelle avec ses membres antérieurs et émet ses spermatozoïdes en même temps que les ovocytes sont émis du cloaque de la femelle. Chez l’Homme, seuls 2 millions de spermatozoïdes sur les 60 millions éjaculés traversent cette barrière. L’observation des modifications de la glaire cervicale au cours du cycle sexuel féminin est à la base d’une méthode de contraception (la méthode de Billings) dont l’efficacité est cependant très inférieure à la pilule contraceptive et au préservatif.
Préparation des Gamètes : Capacitation et Réaction Acrosomiale
Un spermatozoïde éjaculé ne pourra pas directement féconder un ovocyte. Des modifications induites par les voies génitales femelles (utérus et surtout oviducte) doivent avoir lieu. C’est la capacitation. Les propriétés membranaires sont alors modifiées avec une perte de cholestérol membranaire et une concentration à l’avant de l’acrosome des radeaux lipidiques membranaires importants pour la fécondation. Il y a hyperactivation de la nage liée à une entrée de Ca2+ dans le cytoplasme qui aboutit à la phosphorylation et à l’activation des dynéines flagellaires. Des récepteurs spermatiques sont démasqués (perte des glycosides de surface ajoutés dans l’épididyme qui bloquent les récepteurs aux protéines de la zone pellucide de l’ovocyte). Les microfilaments d’actine sont réorganisés ce qui est essentiel pour la future réaction acrosomiale (Schiavi-Ehrenhaus et al., 2022).
Voies de Signalisation et Flux Ioniques dans la Capacitation
L’élimination du cholestérol de la membrane plasmique des spermatozoïdes vers les accepteurs présents dans l’utérus et les trompes de Fallope, tels que l’albumine, entraîne une modification biophysique de la membrane plasmique. De plus, les spermatozoïdes sont exposés à une concentration plus élevée de HCO3- au moment de l’éjaculation et pendant leur transit dans l’appareil reproducteur féminin. Le transport de ce HCO3- à travers les cotransporteurs NBC active ADCY10, une adénylate cyclase, provoquant une augmentation de la concentration d’AMPc, conduisant à l’activation de la PKA. La phosphorylation par PKA est essentielle pour l’activité du transporteur CFTR, et avec d’autres cotransporteurs Cl−/HCO3- (SLC A3/6/8), elle conduit à une augmentation encore plus grande de HCO3- dans le cytosol. D’autres sources possibles de HCO3- peuvent être liées à l’action des anhydrases carboniques. Parallèlement, HCO3- provoque augmentation du pH intracellulaire des spermatozoïdes. Cette alcalinisation du cytosol est également favorisée par l’efflux de protons à travers les canaux Hv1. L’alcalinisation et certains stéroïdes présents dans l’appareil reproducteur féminin comme la progestérone activent les canaux CatSper et produisent une augmentation importante de [Ca2+] intracellulaire. Via une chaine d’enzymes, cela va provoquer une phosphorylation des moteurs dans le flagelle qui stimule la nage. Les niveaux de [Ca2+] intracellulaires sont également régulés par l’action d’échangeurs et de pompes comme le NCX et le PMCA. L’activation des voies AMPc/PKA conduit également à une hyperpolarisation de la membrane plasmique.
La Réaction Acrosomiale : Une Étape Clé
La réaction acrosomiale est une exocytose dépendant du Ca2+ qui permet au spermatozoïde d’excréter le contenu de son acrosome. Dans les modèles classiques, elle était dépendante de l’interaction avec la zone pellucide. Il semble cependant que la réaction acrosomiale puisse avoir lieu avant, indépendamment de la zone pellucide. Cette réaction libère des enzymes notamment la hyaluronidase qui permet au spermatozoïde de se frayer un chemin à travers la corona radiata et la zone pellucide. Une autre enzyme libérée par la réaction acrosomiale, l’acrosine, joue un rôle plus controversé. Son inhibition par des anticorps chez le lapin et sa mutation perte-de-fonction chez le hamster par Crispr-Cas9 diminuent l’efficacité de la fécondation par les spermatozoïdes par ralentissement de la traversée de la zone pellucide mais des spermatozoïdes de souris ou de rats déficients en acrosine la traversent correctement (Hirose et al., 2020). Des réactions acrosomiales trop précoces peuvent aboutir à de l’infertilité (Tesarik et Mendoza, 1995). Son déclenchement est donc étroitement régulé.
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Navigation Spermatique et Attraction vers l'Ovocyte
C’est au sein de l’oviducte que la nage flagellaire devient cruciale. Les spermatozoïdes ont besoin de mécanismes de navigation pour nager dans la bonne direction. Ces mécanismes de navigation reposent sur des signaux biochimiques et biophysiques externes (Tung et al., 2015). Les spermatozoïdes sont guidés par un gradient de température (thermocline de 2°C) le long de l’oviducte (de l’entrée à la région appelée ampoule où a lieu la fécondation). Les spermatozoïdes capacités sont très sensibles aux variations de température et ils sont capables de détecter un gradient de 0,014°C par millimètre ! Sur la membrane plasmique du spermatozoïde, un canal calcique activable par la progestérone appelé CatSper stimule la nage flagellaire. CatSper est un complexe de 9 protéines : 4 qui forment un canal et 5 protéines régulatrices. Sachant que les cellules de la corona radiata entourant l’ovocyte sécrètent de la progestérone, cela permet d’expliquer la chémoattraction des spermatozoïdes. Les cellules entourant l’ovocyte sécrètent également la protéine CRISP1 qui se lie aussi à CatSper (Ernesto et al., 2015). Il modulerait la nage des spermatozoïdes à proximité du l’ovocyte et des cellules environnantes pour la rendre plus efficace. Seuls 200 spermatozoïdes environ finiront par atteindre l’ovocyte.
La Zone Pellucide : Barrière et Facilitateur
Chez les Mammifères, la zone pellucide est une matrice glycoprotéique qui entoure les ovocytes et a une épaisseur moyenne de 17 µm. Elle est essentielle pour la fécondation (plus précisément pour la reconnaissance des gamètes et pour la prévention de la polyspermie), et pour la protection des embryons précoces avant l’implantation. La zone pellucide est composée essentiellement de glycoprotéines appelées ZP1 à ZP4. Chaque protéine ZP est un polypeptide qui est glycosylé de manière hétérogène avec des oligosaccharides liés à l’asparagine (N-) et à la sérine/thréonine (O-) qui, dans certains cas, sont sialylés et sulfatés. Chez certains mammifères, tels que le chat, la vache, le chien et le porc, ZP1 n’est pas présent et sa fonction est complètement remplacée par ZP4. Chez la souris, ZP4 n’est pas présent puisqu’il est codé par un pseudogène qui n’est pas exprimé lors de l’ovogenèse (Goudet et al., 2008). ZP1 et ZP4 proviennent de la duplication récente d’un gène ancestral et cela est suivi des vicissitudes habituelles dans ce cas avec de possibles transformations en pseudogènes ou délétion par redondance fonctionnelle (Smith et al., 2005). ZP2 est assez apparenté à ZP1 et ZP4. Chez la souris, le knock-out ciblé soit du gène codant ZP2 soit du gène codant ZP3 empêche le développement d’une zone pellucide, conduisant à la stérilité. Des cas de stérilité dans une famille ont été reliés à une mutation dans ZP1 qui aboutit à une protéine aberrante qui reste dans le cytoplasme. ZP2 et ZP3 semblent être les glycoprotéines sur lesquelles s’attache le spermatozoïde lors de son arrivée dans la zone pellucide. La comparaison des séquences de ZP3 de différentes espèces de mammifères révèle un degré élevé de divergence dans son domaine d’interaction avec le spermatozoïde par rapport à d’autres régions de la protéine. Cette divergence est attribuée à une sélection darwinienne positive et assure sans doute une importante barrière d’espèce (Williams et al., 2005).
Fusion des Membranes et Activation de l'Ovocyte
La fusion des membranes plasmiques des 2 gamètes est initiée par l’interaction de IZUMO sur la membrane plasmique du spermatozoïde et de JUNO sur celle de l’ovocyte (Bianchi et al., 2014; Aydin et al., 2016). Izumo est une protéine transmembranaire du spermatozoïde et Juno est une protéine ancrée à la membrane de l’ovocyte par un GPI (glycosylphosphatidylinositol). Les souris mâles déficientes en Izumo (mais pas les souris femelles) sont stériles car le sperme dépourvu d’Izumo ne peut pas fusionner avec les ovules. La zone pellucide des ovocytes Juno−/− est pénétrée in vivo par des spermatozoïdes de type sauvage, mais ceux-ci ne fusionnent pas avec l’ovocyte muté. Juno devient rapidement indétectable de la surface cellulaire après la fécondation.
Conséquences de la Fusion
Depuis récemment, on sait que des mitochondries de la pièce intermédiaire du spermatozoïde passent dans le cytoplasme de l’ovocyte mais elles sont éliminées par autophagie. La transmission uniquement maternelle des mitochondries est ainsi préservée. Chez les amphibiens, l’arrivée du spermatozoïde se fait toujours par l’hémisphère animal. Elle entraîne un blocage de la polyspermie rapide sous la forme d’une dépolarisation membranaire. Une augmentation de la concentration du Ca2+ cytoplasmique provoque l’exocytose des granules corticaux.
L'Ovulation : Libération de l'Ovocyte
La maîtrise du moment de l’ovulation chez les mammifères d’élevage permet d’améliorer la fertilité, la gestion des mises bas, mais les méthodes actuelles sont basées sur l’utilisation de fortes doses d’hormones. L’ovulation est l’émission du gamète femelle. Ce phénomène est précédé quelques jours avant par un comportement spécifique : le comportement d’œstrus qu’on résume souvent par le terme « œstrus ». Selon les espèces, le comportement d’œstrus peut se poursuivre quelques heures après l’ovulation. Pendant la phase d’œstrus, la femelle développe une série de comportement pour attirer les mâles et elle accepte l’accouplement.
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Les Phases du Cycle Œstral
Le terme d’œstrus dérive du nom grec « οιστροξ » désignant les œstres, diptères de la famille des œstridés qui infligent des morsures au bétail l’été. Les femelles en œstrus montrent un comportement qui est similaire à celui des animaux en présence d’une grande quantité d’œstres ou de taons : agacement, fouaillement de la queue, etc. Le terme d’œstrus a été utilisé la première fois pour décrire la période du cycle où se déroule l’ovulation par Walter Heape dans son ouvrage dédié aux différents types de cycles reproducteurs chez les mammifères (Heape, 1900). Heape définissait l’œstrus, en miroir du rut chez le mâle, comme « the special period of sexual desire of the female ». Les autres phases du cycle se définissent par rapport à l’œstrus : le pro-œstrus (orthographié également prœstrus) et le post-œstrus qu’on appelle maintenant metœstrus.
Le prœstrus correspond à la phase folliculaire pendant laquelle une ou plusieurs vagues de follicules croissent et par la suite dégénèrent (atrésie) lorsque le ou les follicules destinés à continuer leur croissance (follicules dominants) sont sélectionnés. Durant le prœstrus, les follicules sécrètent des œstrogènes mais en quantité insuffisante pour induire le comportement sexuel. Plusieurs vagues folliculaires peuvent se succéder durant cette phase. Le metœstrus correspond à la phase lutéale au cours de laquelle les cellules folliculaires se transforment en cellules lutéales (lutéinisation), forment le corps jaune et sécrètent de la progestérone. La phase d’œstrus correspond à la phase du comportement sexuel qui s’exprime quand les taux d’œstrogènes circulants sont élevés lorsque le ou les follicules dominants sont en croissance terminale. Au moment de l’ovulation les cellules de la granulosa se transforment en cellules lutéales et perdent leur capacité de sécréter des œstrogènes. La chute des œstrogènes plasmatiques s’accompagne de l’arrêt du comportement sexuel chez certaines espèces et donc du refus du mâle.
Importance de la Connaissance du Moment de l'Ovulation
La connaissance du moment précis de l’ovulation permet d’augmenter les chances de fécondation lors de l’utilisation de l’Insémination Artificielle (IA), particulièrement lors d’utilisation de semence cryoconservée car les spermatozoïdes ont une période de fécondance plus courte.
Types d'Ovulation
On distingue deux types d’ovulation chez les mammifères domestiques : l’ovulation spontanée et l’ovulation provoquée. L’ovulation spontanée est déclenchée au cours de la période d’œstrus que la femelle soit en présence de mâles ou non. C’est le cas de la plupart des mammifères d’élevage. Dans le cas de l’ovulation provoquée, celle-ci n’intervient que lorsque la femelle s’accouple avec le mâle. Ainsi la durée de la phase d’œstrus peut être très variable, et ne s’arrête que lorsque la femelle s’accouple. C’est le cas chez la lapine, la chatte, et des femelles de certaines espèces de camélidés comme le dromadaire, le lama et l’alpaga.
Ovulation Spontanée vs. Ovulation Provoquée : Stratégies Évolutives
L’existence de deux modalités de déclenchement de l’ovulation chez les mammifères peut être discutée sous l’angle de l’écologie comportementale et de l’évolution. Les différentes stratégies évolutives empruntées par les espèces, reposent essentiellement sur l’optimisation de la production d’une descendance viable présentant une bonne survie. Chez les espèces à ovulation induite, le premier mâle qui s’accouple avec la femelle fécondera l’ovocyte (espèce mono-ovulante) ou la majorité des ovocytes (espèce poly-ovulante). Chez les espèces à ovulation spontanée, c’est le mâle qui s’accouple avec la femelle au temps t le plus proche de l’ovulation qui fécondera l’ovocyte ou la majorité des ovocytes. Mais les mâles ne peuvent pas prédire le moment de l’ovulation avec précision, il est probable que leurs spermatozoïdes entrent en compétition spermatique avec les spermatozoïdes des autres mâles qui l’auront précédé ou succédé (Soulsbury, 2010). On s’attend ainsi à observer un niveau plus élevé de compétition entre mâles (par exemple compétition spermatique) chez les espèces à ovulation spontanée que chez les espèces à ovulation provoquée.
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La capacité des mâles à monopoliser la paternité dépend de plusieurs facteurs qui ont été bien démontrés comme l’existence de phénomènes de synchronisation de l’œstrus chez les femelles, la structure familiale et l’existence d’association mâle-femelle. Chez les mâles d’espèces à ovulation spontanée, l’association intermittente mâle-femelle est corrélée à une perte de monopolisation de la paternité, ce qui n’est pas le cas pour les mâles d’espèces à ovulation provoquée. Ainsi, le mode d’ovulation apparaît comme une stratégie évolutive de l’espèce permettant une meilleure monopolisation parentale des mâles (Soulsbury, 2010). Les raisons pour lesquelles certaines espèces ont évolués vers l’un ou l’autre mode d’ovulation, ne sont cependant pas très claires. Un certain nombre d’espèces à ovulation provoquée vivent en groupe et avec des associations mâle-femelle. Le mode d’ovulation provoquée permet de diminuer le niveau de compétition spermatique et donc de compétition entre mâles, mais les facteurs responsables de la stratégie évolutive ne sont pas connus.
Le Rôle de l'Hormone Lutéinisante (LH)
Il est classiquement admis que l’ovulation est la conséquence d’une décharge d’hormone lutéinisante (LH) sécrétée par l’hypophyse. Au moment de l’ovulation, la concentration plasmatique de LH atteint des valeurs très élevées, on parle de pic pré-ovulatoire de LH. Par exemple chez la brebis, la concentration de LH varie de 2 à 8 ng/mL alors qu’au cours du pic préovulatoire elle peut atteindre 30 à 60 ng/mL. Toujours chez la brebis, la durée du pic préovulatoire est d’environ 12 heures (Caraty et al., 1998). L’ovulation intervient 24-36 heures après le maximum du pic de LH (Driancourt et al., 2014). Chez la truie, le pic de LH dure environ 24 heures et l’ovulation intervient 24-64 heures après le début du pic de LH (Martinat-Botté et al., 1997). Chez la vache, le pic de LH dure 12 à 45 heures selon la race et le statut physiologique (Wiltbank et Pursley, 2014), l’ovulation intervient dans les 24 à 30 heures après le maximum du pic de LH (Saumande et Humblot, 2005). Une exception, la jument, pour laquelle le pic de LH dure plusieurs jours et dont le maximum est atteint 24 heures après l’ovulation (Noden et al., 1975).
Ovulation Provoquée : Mécanismes
Plusieurs espèces de mammifères domestiques ont une ovulation provoquée : la chatte, la lapine et certains camélidés. L’hypothèse de l’origine nerveuse du réflexe d’ovulation avait été renforcée par l’observation de nombreuses terminaisons nerveuses autour des follicules et par la présence de fibres musculaires dans la couche fibreuse chez la lapine. Cependant, la LH induit l’ovulation chez la lapine et il a été alors conclu que le réflexe conduisant à l’ovulation impliquait un facteur hypothalamique qui entrainait la sécrétion hypophysaire de la LH. Chez l’alpaga, le lama et le dromadaire, l’ovulation est aussi induite par le coït, mais c’est un facteur présent dans le liquide séminal du mâle, l’« Ovulation Inducing Factor » (OIF), qui est impliqué. L’OIF injecté par voie intramusculaire ou intra-utérine à des femelles alpaga induit un pic de LH qui démarre deux heures après l’injection, l’ovulation intervient 24 à 30 heures après (Tanco et al., 2011).
Processus Moléculaires de l'Ovulation
L’ovulation est un processus complexe au cours duquel sont induits à la fois la reprise de méiose de l’ovocyte, l’expansion du cumulus, la rupture du pôle apical du follicule, et la différenciation des cellules de la granulosa et de la thèque menant à la formation du corps jaune. Au cours d’un cycle normal, tous ces événements doivent être coordonnés pour aboutir à la production d’un ovocyte mature et fécondable, et d’un corps jaune capable d’assurer le début de gestation.
Une cascade d’événements mène à l’ovulation, mais l’initiateur est le pic de LH. Seuls les follicules qui expriment une grande quantité de récepteurs de la LH à la surface des cellules de granulosa sont capables d’ovuler en réponse au pic préovulatoire de la LH (tableau 1). La LH se fixe sur ses récepteurs au niveau des cellules folliculaires qui répondent à ce signal par la régulation de l’expression de plusieurs (figure 1). La fixation de la LH sur son récepteur augmente les taux intracellulaires d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et d’inositol tri-phosphate (Piquette et al., 1991), mais cette dernière voie ne serait néanmoins qu’une voie potentialisatrice (figure 1), activée seulement en présence de forte concentration hormonale. Ainsi activée par l’AMPc, la Protéine Kinase A (PKA) induit une cascade de phosphorylation et d’activation de facteurs de transcription (CREB, SP1) qui vont inhiber, ou activer l’expression de gènes-cibles codant pour des enzymes de la stéroidogenèse. Ainsi, dans les heures suivant l’augmentation circulante de la LH, les taux sériques d’œstrogènes et d’androgènes s’effondrent, alors que le taux de progestérone augmente considérablement. En réponse à une production accrue de monoxyde d’azote (NO ; activité vasodilatatrice) la thèque devient œdémateuse et hyperhémique, augmentant le flux sanguin du follicule préovulatoire et la perméabilité vasculaire. Simultanément, les cellules de la granulosa perdent leurs récepteurs de la FSH, tandis que l’expression des récepteurs de la LH diminue de façon transitoire.
Réaction Inflammatoire Associée à l'Ovulation
Le processus d’ovulation est associé à une réaction de type inflammatoire. La synthèse ovarienne de cytokines inflammatoires (IL, TNFα), de prostaglandines et de cortisol (à action anti-inflammatoire) s’accentue dans le follicule préovulatoire au moment de l’ovulation chez la souris, la ratte, la lapine, la truie, la vache, la jument et la femme. L’interleukine 1 (IL-1) est capable d’induire la rupture du follicule ex vivo, sur des ovaires perfusés de ratte et de lapine (Brännström et al., 1993 ; Takehara et al., 1994) et in vivo chez la jument après injection intrafolliculaire de follicules dominants (Martoriati et al., 2003). Le mécanisme d’action des cytokines dans la maturation préovulatoire est probablement similaire à celui observé au cours d’une inflammation. En particulier elles stimulent la production de prostaglandines, NO, et l’activité d’enzymes protéolytiques. De plus, elles sont capables de moduler la stéroidogenèse et interviendraient aussi dans la maturation du complexe ovocyte-cumulus chez la lapine et la jument (Gérard et al., 2004).
Rupture Folliculaire et Protéolyse
La rupture de la paroi folliculaire et l’expulsion de l’ovocyte dans l’oviducte nécessitent l’action d’enzymes protéolytiques dégradant la matrice extracellulaire. La production locale d’activateur du plasminogène, de plasmine et de collagénases (métalloprotéases MMP1 et MMP2) augmente considérablement. L’activateur du plasminogène transforme le plasminogène en plasmine, qui elle-même activerait certaines collagénases (Beers et al., 1975). L’augmentation préovulatoire de la concentration intra-folliculaire de la progestérone stimule la synthèse et l’activité de deux autres protéases ADAMTS1 et CTSL1, qui viennent participer à la protéolyse. En parallèle, l’activité d’inhibiteurs de sérines protéases (SERPIN) et les inhibiteurs des métalloprotéases matricielles (TIMP1 et TIMP2) augmente. L’expression de ces métalloprotéases et des TIMP est régulée par les stéroïdes et les prostaglandines.
Maturation Ovocytaire
En réponse au pic préovulatoire de la LH, l’ovocyte, bloqué au stade de prophase de 1ère division méiotique, entre en phase de maturation en reprenant sa méiose. Ce stade appelé GVBD (germinal vesicle break down) est visualisé par la rupture de la membrane nucléaire. L’ovocyte évolue, dans la plupart des espèces mammaliennes jusqu’en métaphase de 2ème division méiotique, stade auquel l’ovocyte reste bloqué jusqu’à la fécondation. Les mécanismes moléculaires de la maturation ovocytaire nucléaire et cytoplasmiques sont complexes et ils ne seront pas abordés dans le cadre de cette revue. La LH induit l'expansion du cumulus, phénomène nécessaire à la maturation méiotique et l’acquisition de la compétence au développement de l’ovocyte.
Contrôle Hormonal de la Croissance Folliculaire et de l'Ovulation
La croissance folliculaire et l’ovulation dépendent des hormones gonadotropes ou gonadotropines, FSH et LH, sécrétées par les cellules gonadotropes de l’hypophyse. La synthèse et la libération de la LH et de la FSH sont dépendantes d’une interaction complexe de multiples signaux endocrines et paracrines.
Rôle de la GnRH
La synthèse et la libération des deux hormones gonadotropes LH et FSH sont sous la dépendance de la neurohormone hypothalamique, la GnRH (voir chapitre 2.3.a). Son rôle a été bien établi par l’utilisation d’antagonistes de GnRH (Brooks et al., 1993) ou d’anticorps anti-GnRH (Caraty et al., 1984 ; Molter-Gérard et al., 1999). Ces traitements induisent une suppression immédiate de la libération de la LH, la disparition du pic préovulatoire et le blocage de l’ovulation. La GnRH est libérée sous forme pulsatile par les neurones et elle atteint l’hypophyse via le système sanguin porte hypothalamo-hypophysaire (figure 2) Elle induit à son tour une libération pulsatile des hormones gonadotropes. La fréquence des pulses de GnRH varie au cours du cycle œstral (figure 3) : chez la brebis, elle est de l’ordre d’un pulse/heure au cours de la phase folliculaire puis devient continue au cours de la période précédant l’ovulation. À l’issue de l’ovulation, cette fréquence devient basse avec une valeur d’un pulse toutes les six heures durant la phase lutéale chez la brebis (figure 3). La fréquence des pulses conditionne la libération des hormones gonadotropes. Une fréquence élevée favorise la libération de la LH, une fréquence faible favorise la production de la FSH (figure3) (Dalkin et al., 1989). Au cours du pic préovulatoire de la LH on observe un pic de FSH de moindre amplitude (figure 3) qui permet le recrutement de follicules pour le cycle suivant. Alors que la synthèse et la libération de la LH sont intimement dépendantes de celle de la GnRH, celles de la FSH impliquent d’autres molécules (voir §2.2.d).
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