Depuis l'avènement de la génétique moléculaire, les biologistes s'efforcent de comprendre comment l'ovule fécondé se transforme en un organisme composé de centaines de types de cellules spécialisées, chacune exprimant un ensemble défini de gènes. Cette quête a conduit à explorer les mécanismes fondamentaux qui régissent le développement normal, en particulier la reprogrammation de l'identité cellulaire et le rôle de la chromatine dans ce processus. Cet article se penche sur l'état de la chromatine dans l'ovule fécondé, en explorant la reprogrammation épigénétique, l'empreinte génomique parentale et les mécanismes moléculaires impliqués.
Reprogrammation de l'identité cellulaire
La reprogrammation de l'identité cellulaire est un processus essentiel qui se produit lors du développement précoce et dans la lignée germinale. Initialement, la question était de savoir si la spécialisation des cellules résultait d'une perte progressive de l'information génétique ou d'une expression différentielle des gènes. Les expériences pionnières de clonage par transfert nucléaire ont validé la seconde hypothèse, démontrant que l'embryogénèse procède par restriction progressive du potentiel d'expression des gènes, plutôt que par leur perte.
Clonage et reprogrammation : un aperçu historique
Les premiers cours sur ce sujet ont retracé l'histoire du clonage et de la reprogrammation, en commençant par la théorie du plasma germinatif proposée à la fin du XIXe siècle par August Weismann et Wilhelm Roux. Ces biologistes postulaient que les cellules germinales possèdent la totalité de l'information contenue dans le noyau de l'œuf fécondé, tandis que cette information serait perdue pendant la différenciation des cellules somatiques.
Les expériences de clonage par transfert nucléaire dans les années 1950 et 1960 ont démontré que la différenciation des cellules somatiques est un processus réversible, puisqu'un animal entier pouvait être obtenu à partir d'un noyau issu d'une cellule somatique. En d'autres termes, ces travaux ont établi que la différenciation résulte de l'expression différentielle des gènes plutôt que de leur élimination au cours des divisions cellulaires successives.
Le clonage naturel est un phénomène courant dans le règne végétal, notamment pour la vigne. Cependant, les tentatives de clonage chez différentes espèces de mammifères ont soulevé des questions éthiques, en particulier chez l'homme. La découverte et la manipulation des cellules souches embryonnaires chez la souris ont ouvert la voie à l'obtention des premières cellules souches pluripotentes induites (iPS) à partir des cellules somatiques.
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Mécanismes de reprogrammation naturelle
Le deuxième cours s'est concentré sur les mécanismes en jeu lors de la reprogrammation naturelle au cours du développement précoce et dans la lignée germinale. Les études chez la souris ont montré une forte dynamique des marques épigénétiques telles que la méthylation de l'ADN et la modification des histones. Ainsi, pour un même génome dans toutes les cellules ou presque, il existe une multitude d'épigénomes, chacun caractéristique d'un type cellulaire précis et composé de marques épigénétiques permettant le cas échéant la mémorisation des états transcriptionnels des gènes au travers des divisions des cellules.
Après la fécondation de l'œuf, certaines cellules de l'embryon migrent jusqu'à la crête génitale où elles deviendront des cellules germinales. Cette différenciation s'accompagne d'une reprogrammation intense de l'épigénome, qui se caractérise par l'effacement de marques épigénétiques à l'échelle du génome entier et l'acquisition de nouvelles marques associées à la totipotence/pluripotence des cellules.
Cellules pluripotentes induites (iPS)
Le troisième cours a porté sur les cellules pluripotentes induites (iPS). Les expériences de Shinya Yamanaka ayant conduit à l'obtention de cellules iPS ont été décrites en détail, ainsi que les implications expérimentales et éthiques de l'utilisation de ces cellules, avec un accent mis sur leur potentiel pour l'étude des processus de différenciation et/ou comme outil clinique/thérapeutique.
La pluripotence est définie par la capacité des cellules ES et iPS murines à développer un embryon chimérique lorsqu'elles sont injectées dans un blastocyste. Chez l'homme, le critère de pluripotence retenu est la capacité des ES et iPS à induire la formation de tératomes (dérivés des trois tissus embryonnaires) lorsqu'elles sont injectées sous la peau de souris immunodéficientes.
Shinya Yamanaka et ses collègues ont montré que l'état de pluripotence dépend de l'expression de différents facteurs de transcription (OCT4, SOX2, NANOG, SALL4….), ainsi que d'une conformation particulière de la chromatine. Néanmoins, le processus de reprogrammation reste loin d'être compris et les bases génétiques et épigénétiques sont l'objet d'actives recherches.
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Processus de reprogrammation et rôle de l'épigénétique
Le quatrième cours s'est penché sur les différents processus de reprogrammation (y compris le transfert nucléaire, l'expression de facteurs de transcription OKSM, les fusions entre cellules somatiques et cellules ES) ainsi que sur les études récentes permettant la définition des étapes impliquées dans chacun de ces processus. Les données génétiques et biochimiques obtenues suggèrent que l'épigénétique agit comme une barrière à la reprogrammation. De fait, il semble que la chromatine agisse comme un frein aux changements forcés de l'expression génétique.
Les mécanismes moléculaires, comme la méthylation de l'ADN, les modifications des histones et d'autres facteurs épigénétiques ont été discutés dans le contexte de la reprogrammation développementale et induite. Des mécanismes différents émergent : il semble que les variants d'histones jouent un rôle important dans la reprogrammation par transfert nucléaire alors que la reprogrammation naturelle dans la lignée germinale requiert une perte de la méthylation de la lysine 9 de l'histone H3 (H3K9me2), marque épigénétique classiquement associée à l'hétérochromatine.
Applications thérapeutiques et modèles pathologiques
Le cinquième cours a porté sur l'application des cellules iPS comme outil thérapeutique et comme modèle en pathologie. Une première considération concerne les dangers éventuels de ces cellules en clinique. Même si les cellules iPS évitent les inconvénients techniques et éthiques du clonage, l'utilisation de vecteurs d'origine rétrovirale pour introduire les facteurs de transcription OKSM a été associée à des risques d'insertion aléatoire dans le génome.
Différentes stratégies d'introduction, ou même d'induction chimique de l'expression des facteurs de transcription, ont été discutées. Par ailleurs, l'utilisation d'un oncogène potentiel - MYC - dans le cocktail original de Yamanaka a été remplacée par celle d'autres facteurs, réduisant ainsi considérablement les risques d'oncogenèse.
Néanmoins, l'inefficacité de la procédure de production de cellules iPS ainsi que les difficultés persistantes dans la différenciation de ces cellules vers des voies spécifiques rendent les perspectives thérapeutiques chez l'homme incertaines. À l'inverse, l'utilisation des cellules iPS pour l'exploration des maladies cardiaques, hématopoïétiques, neurodégénératives ou autres, est en pleine explosion, avec beaucoup d'espoir pour une meilleure compréhension des bases moléculaires de certains désordres et des perspectives de traitement. En effet, la dérivation des cellules iPS de patients ou d'individus en bonne santé permet le criblage de drogues de manière « personnalisée » et représente un domaine en plein essor.
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Structure et dynamique de la chromatine
La chromatine, complexe d'ADN et de protéines, joue un rôle central dans l'organisation du génome et la régulation de l'expression des gènes. Sa structure dynamique permet d'adapter l'accessibilité de l'ADN aux différents processus cellulaires, tels que la transcription, la réplication et la réparation.
Organisation de base de la chromatine
Dans le noyau, l'ADN génomique est enroulé autour d'octamères de quatre types d'histones (H2A, H2B, H3 et H4) pour former le nucléosome. Les histones sont de petites protéines basiques, ce qui facilite leur liaison à l'ADN, contenant également des queues N-terminales ciblées par différents types de modifications : acétylation, méthylation, phosphorylation, ubiquitylation, sumoylation, ribosylation, désamination et isomérisation.
Ces modifications touchent différents acides aminés, produisant ainsi des dizaines de variants post-traductionnels avec des rôles fonctionnels différents. L'addition ou le retrait de ces modifications sont des processus très flexibles qui affectent directement l'accessibilité de l'ADN génomique par la machinerie de transcription, et donc l'activation ou la répression de l'expression génique. La combinatoire des différentes marques d'histones (« code des histones »), en association avec la méthylation de l'ADN et la présence de certains facteurs de transcription ou de l'ARN polymérase, définissent des états chromatiniens associés à différents états transcriptionnels. Ces états chromatiniens sont transmis aux cellules filles, assurant la continuité de l'identité cellulaire à travers la mitose.
Modifications des histones et états transcriptionnels
Les modifications d'histones reposent sur l'utilisation de métabolites issus de l'alimentation (acétyl-coA et S-adénosylméthionine) et sont contrôlées par une importante machinerie épigénétique, comprenant des enzymes capables d'apposer, d'effacer et de lire ces marques. Les acétylations et désacétylations ont été décrites dès les années 1960. Fruits de l'activité des histones acétyltransférases (HAT), les acétylations ont pour effet de neutraliser la charge positive de l'histone, d'augmenter son encombrement stérique et de diminuer la force de son interaction avec l'ADN. Les lysines acétylées permettent également le recrutement de protéines à bromodomaine qui interviennent dans le remodelage de la chromatine. Il résulte de ces différents modes d'action une ouverture de la chromatine (euchromatine) et une augmentation locale de l'activité transcriptionnelle.
Les processus de désacétylation, qui ont une action opposée sur la transcription, font intervenir les histones désacétyltransférases (HDAC) et sont associés à la formation de l'hétérochromatine (chromatine compacte). Les méthylations, qui consistent en l'addition d'un ou plusieurs groupe(s) méthyle(s) sur les résidus lysines ou arginines des queues d'histones, sont catalysées par des histones méthyltransférases (KMT) tandis que les déméthylations résultent de l'activité des histones déméthylases (KDM).
À la position H3K4, la triméthylation (H3K4me3) est une signature d'activité transcriptionnelle, en particulier lorsqu'elle est combinée avec une acétylation. À l'inverse, la méthylation est associée à une répression transcriptionnelle lorsqu'elle touche H3K27 et H4K20 et à l'hétérochromatine constitutive à la position H3K9, en association avec la protéine HP1 et la méthylation de l'ADN.
Structure de la chromatine dans les spermatozoïdes
Il est important de noter qu'un type de cellule échappe à la structure en nucléosome : le spermatozoïde, où selon les espèces 85 à 99 % des histones sont remplacées par des protamines, protéines riches en arginine formant des structures en forme de tores avec l'ADN.
Méthylation de l'ADN
La méthylation de l'ADN est une modification épigénétique clé qui joue un rôle essentiel dans la régulation de l'expression des gènes et le maintien de la stabilité du génome.
Mécanismes et fonctions de la méthylation de l'ADN
Au sein de la séquence d'ADN, les résidus de cytosine des dinucléotides CpG (pour « cytosine-phosphate-guanine ») peuvent être méthylés en 5-méthylcytosine (5meC). Cette méthylation de l'ADN est connue depuis plus de 50 ans, avec la découverte de la 5meC dans l'embryon d'oursin puis la mise en relation de cette marque épigénétique avec l'activité des gènes au cours du développement. Elle est présente chez presque tous les organismes vivants, mais chez les mammifères, seules 5 à 10 % des cytosines du génome sont méthylées. Ce pourcentage semble faible, mais rapporté aux dinucléotides CpG, il dépasse bien souvent 80 %.
Les sites CpG ne se répartissent pas de manière uniforme le long du génome. Les régions les plus denses en sites CpG sont nommées « îlots CpG » et sont en général méthylées lorsqu'elles sont associées aux éléments répétés du génome, tels que les rétrotransposons (éléments mobiles du génome, d'origine virale accumulés au cours de l'évolution) et les séquences satellites centromériques et péricentromériques. La méthylation de l'ADN au niveau des rétrotransposons, est nécessaire pour prévenir leur réplication et protéger le génome contre leur invasion. La méthylation des séquences satellites péricentromériques intervient quant à elle dans la formation de l'hétérochromatine constitutive, essentielle pour limiter les recombinaisons et ségrégations chromosomiques indésirables.
Au niveau des régions flanquant les îlots CpG, la méthylation de l'ADN est particulièrement dynamique en fonction du type cellulaire, du stade de développement, de la physiologie de l'animal ou de l'environnement. Associée à des éléments régulateurs ou à des promoteurs, la méthylation de l'ADN inhibe l'expression des gènes, tandis qu'au niveau intragénique elle aurait un rôle activateur en limitant les démarrages de transcription illégitimes. La méthylation de l'ADN intervient également dans l'inactivation du chromosome X, qui permet de compenser le double dosage allélique chez les femelles, ainsi que dans les processus d'empreinte parentale décrits pour une centaine de gènes chez l'Homme et la souris.
Enzymes impliquées dans la méthylation et la déméthylation
Les fonctions de la méthylation de l'ADN sont médiées par des protéines nucléaires portant un domaine de liaison à l'ADN méthylé et capables de recruter des répresseurs transcriptionnels ou des enzymes de modification des marques d'histones. Les DNMT (ADN méthyltransférases) sont les enzymes qui catalysent le transfert des groupes méthyle sur la position 5 des cytosines à partir du métabolite S-adénosylméthionine (produit à partir d'acide folique apporté par l'alimentation). Les enzymes DNMT3A et DNMT3B sont impliquées dans la méthylation de novo qui se met en place lors des processus de différenciation cellulaire, mais également en réponse à un stimulus dans les cellules différenciées.
L'enzyme DNMT1, qui reconnaît les sites CpG hémiméthylés issus de la réplication de l'ADN, assure le maintien et la propagation des patrons de méthylation à travers la division cellulaire. La déméthylation peut ainsi résulter d'une absence d'activité de DNMT1, la méthylation de l'ADN étant progressivement diluée au cours des cycles cellulaires. Des mécanismes de déméthylation active de l'ADN sont également observés lors des vagues de reprogrammation épigénétique ayant lieu dans les précurseurs des cellules germinales et l'embryon préimplantatoire.
ARN non codants
La découverte des ARN non-codants a bouleversé le dogme selon lequel chaque gène codait une protéine possédant une fonction cellulaire. Des recherches récentes ont mis en évidence de nombreuses formes d'ARN non-codants soulignant leurs rôles dans la physiologie et leurs implications dans de nombreuses pathologies.
Classification et fonctions des ARN non codants
Les ARN non-codants sont divisés en sous-classes selon leur taille, leur fonction ou leur localisation génomique. Les petits ARN non-codants comprennent les ARN dont la taille est inférieure à 200 nucléotides, parmi lesquels les microARN (miARN, 19-24 nucléotides). Chez les mammifères, plus de 2 000 miARN par espèce sont actuellement répertoriés dans la base publique de référence miRBase.
Au niveau génomique, les miARN peuvent être organisés en cluster ; ils partagent alors un promoteur commun et sont transcrits en large polycistrons (grand fragment d'ARN contenant plusieurs miARN). Les gènes de miARN peuvent également être localisés dans les introns de gènes codants ou non. Ces gènes de miARN introniques peuvent soit partager le même promoteur que leur hôte, soit utiliser un promoteur distinct ou même plusieurs sites d'initiation de la transcription.
Biosynthèse et mécanismes d'action des miARN
La biosynthèse de miARN fonctionnels et l'assemblage du complexe RISC (« RNA-induced silencing complex ») font appel à une cascade de réactions enzymatiques se regroupant en cinq étapes : i) transcription du gène codant le miARN sous forme de miARN primaire (pri-miARN), ii) maturation du pri-miARN en précurseur (pré-miARN) au niveau nucléaire, iii) export du pré-miARN du noyau vers le cytoplasme, iv) maturation du pré-miARN en miARN mature et v) formation du complexe RISC.
Ce complexe est guidé par le miARN vers ses transcrits cibles par homologie partielle de séquences entre les deux espèces d'ARN ; il peut induire ensuite l'inhibition de la traduction ou la dégradation des ARN messagers. Un miARN peut ainsi cibler une centaine d'ARNm différents et un ARNm peut être ciblé par plusieurs dizaines de miARN différents.
Rôles des miARN dans les fonctions biologiques
En participant à la régulation de l'expression génique, les miARN ont des rôles clés dans l'ensemble des fonctions biologiques chez les mammifères. Les fonctions des miARN dans la prolifération, la différenciation ou la mort cellulaire sont conservées au cours de l'évolution et entrent en jeu dans toutes les voies biologiques ; citons par exemple la réponse immune, le rythme circadien ou encore le développement cérébral.
Les études de profils d'expression des miARN indiquent que la majorité d'entre eux est sous le contrôle de signaux développementaux et/ou tissus-spécifiques, comme miR-1 qui représente 45 % des miARN exprimés dans le cœur et miR-122 qui représente 72 % des miARN du foie. Le contrôle précis du niveau d'expression des miARN est crucial pour maintenir les fonctions physiologiques de la cellule, et les dérégulations de leur expression sont souvent associées à des pathologies telles que le cancer.
Reprogrammation épigénétique au cours du développement
La reprogrammation épigénétique est un processus essentiel qui se produit au cours du développement, permettant la réinitialisation de l'épigénome et l'acquisition de la pluripotence.
Reprogrammation épigénétique et développement embryonnaire
La reprogrammation épigénétique se définit par un remodelage global de l'épigénome : méthylation de l'ADN, marques d'histones, empreinte parentale et chez les femelles inactivation du chromosome X, un mécanisme épigénétique permettant la compensation de dose entre les sexes. Cette reprogrammation permet la réinitialisation de l'épigénome d'une cellule différenciée et spécialisée. Dans le cas du clonage, la reprogrammation du noyau d'une cellule somatique permet de retrouver un état de pluripotence et la capacité de se différencier vers les trois feuillets germinaux et, par la suite, vers toutes les cellules d'un nouvel individu. Ainsi, la reprogrammation peut être vue comme le chemin inverse des voies de différenciation.
Dynamique de la méthylation de l'ADN au cours du développement
Chez les mammifères, les groupements méthyls (-CH3) affectent uniquement les cytosines, en particulier celles impliquées dans des dinucléotides CpG. Dans le contexte d'une cellule somatique, les îlots CpG (séquences à forte densité de CpG typiquement associées aux séquences promotrices) sont généralement hypométhylés, à l'exception de ceux associés aux gènes soumis à empreinte, aux gènes de la lignée germinale et aux gènes du chromosome X inactif chez les individus femelles. Le reste du génome est fortement méthylé, incluant les séquences répétées, les séquences intergéniques, et le corps des gènes.
Reprogrammation épigénétique des gamètes
La reprogrammation épigénétique serait essentielle à la fonctionnalité des gamètes en amont de la fécondation, et à l'acquisition de la pluripotence de l'embryon après fécondation. Les gamètes sont des cellules hautement spécialisées avec un fort dimorphisme sexuel. À la fécondation, le génome du spermatozoïde arrive dans l'ovocyte dans un état inactif et extrêmement compacté par des protéines alternatives aux histones, appelées protamines. L'ovocyte, en plus de l'ADN maternel, contient tout le bagage moléculaire permettant d'initier le programme développemental avant l'activation du génome embryonnaire.
Le génome du spermatozoïde subit une transformation drastique dans le cytoplasme de l'ovocyte. Il est progressivement décondensé par des histones acétylées apportées par l'ovocyte en remplacement des protamines, puis est soumis à une déméthylation globale de l'ADN impliquant des mécanismes actifs de déméthylation. Le génome maternel est quant à lui déméthylé de façon passive, principalement par dilution au cours des premiers clivages.
Reprogrammation embryonnaire et marques d'histones
Les épigénomes maternel et paternel sont aussi très différents en termes de marques d'histones. Par exemple, du fait du remplacement massif par les protamines, le génome paternel contient peu de marques d'histones telles que H3K9me2, H3K27me3 et H3K4me3, qui n'apparaissent qu'après la première réplication de l'ADN de l'embryon. Malgré ces différences d'organisation chromatinienne, les deux génomes parentaux sont fonctionnellement équivalents au moment de l'activation embryonnaire, à l'exception des gènes soumis à empreinte parentale.
La reprogrammation épigénétique des gamètes conduit également à l'apposition de grands domaines de la marque répressive H3K27me3 qui seront transmis à la descendance par l'ovocyte. La reprogrammation embryonnaire consiste ainsi en un effacement des profils liés à une identité gamétique qui culmine avec un état globalement hypométhylé du blastocyste à la fin du développement pré-implantatoire (environ 20 % de CpG méthylés) ; et ceci est vrai pour les deux lignages principaux, à savoir la masse cellulaire interne et le trophectoderme.
Lignée germinale
La lignée germinale est constituée des cellules qui donneront naissance aux gamètes, assurant ainsi la transmission de l'information génétique à la génération suivante.
Développement de la lignée germinale
La fécondation d'un ovocyte par un spermatozoïde permet la création d'un organisme entier, viable et fertile, comprenant toutes les cellules différenciées nécessaires à son bon fonctionnement, ainsi que les cellules de sa lignée germinale. Ces cellules permettront à leur tour la création de la future génération et ainsi de suite. La lignée germinale peut en ce sens être considérée comme immortelle.
La différenciation sexuelle des gonades en ovaires ou testicules a lieu à partir de E12, puis le devenir des PGC mâles et femelles diverge drastiquement. Chez les femelles, à E13,5, les PGC entrent en méiose I et resteront ensuite bloquées sous forme de follicules primaires en prophase 1 de méiose, jusqu'à reprendre leur progression à la puberté.
Reprogrammation transcriptionnelle et épigénétique de la lignée germinale
Lors de la spécification des cellules germinales primordiales, un programme transcriptionnel spécifique se met en place. BLIMP1 est un répresseur transcriptionnel qui permet de réprimer les gènes de différenciation somatique lors de la reprogrammation de la lignée germinale. Ces changements drastiques du transcriptome sont accompagnés d'une reprogrammation de l'épigénome tout aussi importante.
Le génome atteint alors le plus bas niveau physiologique de méthylation, avec environ 6 % de CpG méthylés. La déméthylation est importante pour éviter une entrée précoce en méiose. À contre-courant, certains éléments transposables, « jeunes » en terme d'évolution, échappent à la reprogrammation, et restent méthylés chez la souris et chez l'homme, vraisemblablement pour préserver l'intégrité du génome contre leur activité.
Les cellules germinales primordiales subissent une perte globale de H3K9me2 entre E8,5 et E9,5, et une forte accumulation de H3K27me3 à partir de E11,5.
Empreinte génomique parentale
L'empreinte génomique parentale est un mécanisme épigénétique qui conduit à l'expression mono-allélique d'un ensemble de gènes, en fonction de leur origine parentale.
Caractéristiques de l'empreinte parentale
Les gènes soumis à empreinte génomique parentale se définissent par une expression mono-allélique en fonction de l'origine parentale, c'est-à-dire qu'un gène sera exprimé de façon mono-allélique soit uniquement à partir de l'allèle maternel, soit uniquement à partir de l'allèle paternel. Ce déterminisme allélique est contrôlé par la méthylation de l'ADN, différentiellement héritée des génomes parentaux.
Cette caractéristique des gènes soumis à empreinte parentale est nécessaire mais non suffisante pour les caractériser. Les motifs de recrutement pour les KZFP sont importants dans la transmission intergénérationnelle de l'empreinte, pour protéger la méthylation de l'ADN héritée des génomes parentaux.
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