Le xénope, en particulier Xenopus laevis et Xenopus tropicalis, est un amphibien largement utilisé comme organisme modèle pour l'étude du développement embryonnaire des vertébrés. Sa facilité d'élevage en laboratoire, la taille de ses œufs, leur développement rapide et la possibilité de manipuler génétiquement ses embryons en font un outil précieux pour les chercheurs. Cet article explore les différentes étapes du développement embryonnaire du xénope, les techniques d'étude utilisées et les applications de ce modèle en recherche.
Caractéristiques générales du xénope
Xenopus laevis, ou dactylère du Cap, est un amphibien anoure originaire d'Afrique australe. Il vit principalement dans l'eau et remonte à la surface pour respirer. Les mâles sont plus petits que les femelles. Ils ont des pattes postérieures musclées avec de larges palmures, ce qui en fait d'excellents nageurs. La couleur de leur peau varie d'un individu à l'autre et peut être influencée par la lumière et le substrat environnants.
Leur mode de vie aquatique facilite leur élevage en laboratoire, car ils se contentent d'un simple aquarium ou d'un bac rempli d'eau sans chlore maintenue à 22°C. Il est préférable de maintenir une température ambiante de 24°C dans la pièce d'élevage.
Les premières étapes du développement embryonnaire
La fécondation et l'orientation de l'œuf
Au sortir de la femelle, les œufs non fécondés présentent deux régions distinctes : une région pigmentée (foncée), appelée hémisphère animal, et une région blanche, appelée hémisphère végétatif. Après la fécondation, l'œuf s'oriente en fonction de la pesanteur. L'hémisphère végétatif, plus dense, se dirige vers le bas, laissant apparaître l'hémisphère animal pigmenté. Un point pigmenté au centre de la tache de maturation marque l'endroit où les globules polaires ont été expulsés.
Les clivages
Environ 2h30 après la fécondation, le premier plan de clivage apparaît, divisant l'œuf en deux cellules identiques. Le second plan de clivage apparaît 20 à 25 minutes plus tard, perpendiculairement au premier. Les clivages suivants se succèdent, divisant l'œuf en plusieurs centaines de cellules.
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Il faut environ 10 heures pour que l'œuf fécondé se clive en plusieurs centaines, voire milliers de cellules. C'est la période de clivage, au terme de laquelle l'embryon devient une blastula.
La gastrulation
Après la période de clivage, des mouvements cellulaires intenses remanient et redistribuent les tissus à l'intérieur de l'embryon. C'est la gastrulation. L'embryon devient une gastrula.
Elle dure une dizaine d'heures. Le xénope est un modèle où l'on peut très facilement observer les mouvements de la gastrulation.
La neurulation et l'organogenèse
Après la gastrulation, d'autres mouvements morphogénétiques dorsaux élaborent le futur système nerveux. C'est la neurulation. L'organogenèse, initiée par la neurulation, s'amplifie avec l'apparition des autres ébauches d'organes qui modèlent le corps de l'embryon au stade du bourgeon caudal.
La neurulation dure moins de 10 heures et l'organogenèse environ 48 heures.
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Du têtard à la grenouille
L'éclosion et la période larvaire
L'éclosion, la prise de nourriture et la croissance caractérisent la période larvaire. La larve porte le nom de têtard. En 3 jours, l'embryon de xénope sort de ses gangues au moment de l'éclosion.
Il faut ensuite compter en semaines pour la période larvaire (environ 5 à 6).
La métamorphose
La période larvaire est suivie d'une métamorphose au cours de laquelle la queue régresse, les pattes s'épaississent et le régime alimentaire se modifie. Le têtard se transforme en grenouille.
La croissance et la maturité sexuelle
Il reste à cet imago de 1 cm de long à croître jusqu'à 6 à 10 cm de long et à acquérir la maturité sexuelle qui définit l'état adulte. Il faut compter en mois de la métamorphose à l'état adulte (6 à 12). Dans leur nature d'origine, les xénopes se reproduisent pendant le printemps austral. Dans nos régions, ils peuvent s'accoupler naturellement en été et en automne à condition qu'ils trouvent des conditions d'élevage pseudo-naturelles dans des aquariums extérieurs (substrat graveleux, plantes aquatiques, nourriture abondante…).
Techniques d'étude du développement embryonnaire chez le xénope
Le xénope offre de nombreuses possibilités pour étudier le développement embryonnaire.
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Observation directe
La transparence de la gangue qui entoure les œufs permet une observation directe des phénomènes. Les images obtenues par microcinéma dévoilent toutes les étapes de l'évolution de l'embryon, de la fécondation au têtard. Des prises de vue accélérées révèlent le clivage des œufs qui conduit au stade blastula, puis les mouvements cellulaires, imperceptibles à l'œil nu, de la gastrulation. Des gros plans in vivo nous dévoilent l'anatomie embryonnaire et larvaire.
Manipulation génétique
L'expression des gènes dans les embryons de xénope peut être facilement manipulée à l'aide de microinjections d'ARNm et d'oligonucléotides morpholino antisens (MO) pour un gain ou une perte de fonction, respectivement.
La technique CRISPR/Cas9 peut être utilisée pour créer des mutations gain ou perte-de-fonction ou générer des lignées rapportrices.
Microchirurgie embryonnaire
Les embryons de xénope et notamment de Xenopus laevis qui sont plus gros se prêtent très bien à des expériences de microchirurgie embryonnaire. Fait important, parce que les premiers stades de clivage sont holoblastiques (par opposition aux clivages méroblastiques chez les embryons de poule ou de poisson zèbre), le vitellus (réserves énergétiques) est distribué à toutes les cellules, de sorte que les explants ne nécessitent aucune nutrition supplémentaire car ils peuvent survivre en utilisant les nutriments stockés dans les cellules. Le tissu disséqué se développe et se différencie dans une simple solution saline.
Marquage de territoire
Un exemple de marquage de territoire chez l’embryon de xénope permet d'établir une carte des territoires présomptifs ou suivre les mouvements de la gastrulation.
Analyse comparative
En effet, l’injection d’une seule cellule de l’embryon à deux cellules peut cibler le côté gauche ou droit de l’embryon. En utilisant des traceurs fluorescents (GFP) ou enzymatiques (β-galactosidase), on peut facilement détecter le côté injecté de l’embryon et le comparer au côté non injecté. De telles manipulations sont très utiles car elles fournissent un contrôle interne chez le même animal pour chaque expérience. En plus de l’injection au stade 2 cellules, les embryons de xénope ont une carte du destin cellulaire bien définie pour chaque système organique. Cela permet des injections ciblées, où l’expression des gènes peut être modifiée dans des organes ou des tissus spécifiques.
Cultures cellulaires
Le xénope est aussi utile pour produire des cultures cellulaires de cellules pluripotentes : les cellules de la calotte (ou coiffe) animale, prélevées sur des blastulas. Sans intervention, ces cellules finissent par se développer en petits organoïdes épidermiques.
Applications du modèle xénope en recherche
Le xénope est utilisé dans de nombreux domaines de la recherche biologique.
Étude du développement embryonnaire
Le modèle xénope est représentatif des vertébrés en ce qui concerne les grandes étapes successives du développement. Il permet d'étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires qui contrôlent la formation des organes et des tissus.
Génétique et biologie cellulaire
Le xénope a aussi permis des avancées dans des domaines de génétique et de biologie cellulaire plus fondamentaux.
Toxicologie
Le xénope est utilisé pour tester la toxicité de substances chimiques sur le développement embryonnaire.
Recherche sur les maladies humaines
Le génome des xénopes a une conservation importante avec l’Homme. Celui de Xenopus tropicalis contient des orthologues pour environ 79 % des gènes identifiés dans les maladies humaines. Le xénope est donc un modèle pertinent pour étudier les mécanismes moléculaires de certaines maladies humaines.
Test de grossesse
Historiquement, Xenopus laevis a été utilisé comme test de grossesse (test de Hogben). De l’urine en provenance de la femme dont on veut savoir si elle enceinte est injectée dans une femelle Xénope. Si au bout de 48 heures, une ponte s’est déclenchée, cela veut dire que l’urine de la femme contenait de l’hCG (ou hormone chorionique gonadotropique) produite par le placenta et qui a provoqué la ponte des xénopes.
L'élevage du xénope en laboratoire
Conditions d'élevage
Le mode de vie aquatique de ces animaux favorise leur élevage en laboratoire. À l’inverse de la plupart des autres amphibiens qui nécessitent l’aménagement d’un aquaterrarium, le xénope se satisfait d’un simple aquarium ou d’un bac dans lequel il vit en pleine eau. L’eau d’élevage doit être dépourvue de chlore et la température maintenue à 22 °C. Il est préférable de consacrer à l’élevage, une pièce thermostatée à 24 °C de façon à corriger la déperdition de chaleur de l’eau des bacs. Cette pièce sera éclairée par un plafonnier en tubes fluorescents type Néon blanc Mazda Fluor SF36W/AZU965.
Nettoyage des bacs
Les animaux de chaque bac sont tour à tour retirés et stockés temporairement à part. Les bacs sont vidés, nettoyés, grattés sans détergent à l’aide d’une éponge type « scotch brite », rincés abondamment et remplis avec une eau à 22 °C. L’eau est délivrée à la bonne température grâce à un ballon chauffe-eau thermostaté.
Alimentation des larves
Dès que les larves sont capables de se nourrir, elles sont placées dans des aquariums à raison de 10 têtards par litre d’eau déchlorée (ou mieux, de l’eau de source) aérée par un bulleur. Les têtards sont microphages. Ils filtrent les boues déposées sur le fond de l’aquarium. Ces boues sont constituées par des décoctions d’orties séchées ou des poudres de potage du commerce (Knorr). On peut également ajouter un peu de levure de boulanger. Pendant leur activité de filtrage, les têtards adoptent une position stationnaire, le corps oblique, la tête tournée vers le fond de l’aquarium. Seule l’extrémité de la queue est animée d’un battement rapide pour maintenir l’inclinaison du têtard. Bien que le filtrage assuré par les têtards contribue à éclaircir l’eau de l’aquarium, il faut changer l’eau et nettoyer l’aquarium dès que les boues commencent à proliférer.
Alimentation des jeunes grenouilles
Les têtards atteignent la métamorphose deux mois et demie après la ponte. Pendant cette période les animaux ne se nourrissent plus. La métamorphose achevée, les jeunes grenouilles se nourrissent de proies vivantes adaptées à leur taille qui est de l’ordre du centimètre. Ce sont principalement des larves de chironomes couramment vendues dans les boutiques spécialisées en aquariophilie.
Santé des xénopes
Le xénope est plutôt résistant aux agents infectieux connus chez les amphibiens. L’infection la plus répandue est la « red leg septicemia » qui se manifeste par des lésions cutanées, des œdèmes sous-cutanés et une inflammation du réticule veineux peaucier notamment au niveau des pattes. Les agents infectieux sont bactériens tels que Aeromonas et Pseudomonas. Les animaux atteints doivent être isolés rapidement à cause du caractère contagieux de l’infection. Les atteintes fongiques peuvent survenir sur d’éventuelles plaies cutanées.
Identification des individus
L’une des méthodes les plus simples est de couper des griffes aux trois doigts internes des pattes postérieures et de convenir d’un code tenant compte des différentes combinaisons, comme de lire les dizaines sur la patte de gauche et les unités sur celle de droite. L’inconvénient est que les griffes repoussent en quelques mois, ce qui nécessite d’entretenir le marquage. La méthode la plus sure est d’effectuer des autogreffes de la peau ventrale sur le dos de l’animal.
Reproduction artificielle
L’ovulation peut être obtenue artificiellement avec des hormones gonadotropes du commerce. Afin de garantir le succès de cette opération, il est préférable de préparer plusieurs femelles. Celles-ci peuvent être stimulées tous les 3 mois dans des conditions d’élevage et d’alimentation optimales. L’ovulation est induite par l’injection d’hormone gonadotrope chorionique (Chorionic Gonadotropin, Sigma, 10.000 I.U. per vial, code CG-10) dans les sacs lymphatiques dorsaux. Afin d’éviter le reflux il est conseillé de piquer l’aiguille dans le haut de la cuisse à travers un septum et de serrer le lieu d’injection pendant quelques secondes au moment de retirer l’aiguille. Des glandes cutanées secrètent un mucus abondant qui enduit la peau et rend les animaux extrêmement glissants. Les femelles en stimulation sont ensuite remises séparément dans un aquarium situé à l’écart et recouvert d’un couvercle faisant écran, dans une pièce isolée du passage des personnels afin d’éviter toute forme de stress qui risquerait de compromettre le succès de la ponte. Dans ces conditions, les animaux commencent à pondre une douzaine d’heures après la piqûre, à la température ambiante de 22 °C. Elle est naturellement productive chez les mâles pourvus de caractères sexuels secondaires bien visibles tels que les callosités noirâtres des membres antérieurs. Dans le cas contraire la spermatogenèse peut être stimulée chez le mâle par stimulation hormonale (deux injections d’hormone gonadotrope 50 I.U.
Une fois stimulés, les animaux présentent des caractères sexuels secondaires. Les mâles à maturité portent des épaississements épidermiques pigmentés, kératinisés et rugueux sur la surface interne des membres antérieurs. La femelle expulse périodiquement des grappes de plusieurs dizaines d’ovocytes que le mâle arrose de sa semence simultanément. Les œufs fécondés peuvent être ainsi récoltés aisément sur le fond du bac à l’aide d’une pipette en verre avec une embouchure supérieure à 2 mm de diamètre. Cette méthode présente l’avantage d’être naturelle et ne nécessite pas de prélèvement chirurgical. À mesure que les ovocytes transitent par les voies génitales femelles, ils sont transitoirement accumulés dans la région distale de l’oviducte renflée. Il est alors possible de les récolter environ toutes les heures par lots de quelques dizaines voire une centaine. Pour ce faire, il faut saisir la femelle à pleine main de façon à la maintenir en contention tout en dirigeant le cloaque vers la coupelle où les œufs doivent être déposés. Cette manipulation, plutôt délicate, nécessite de la dextérité et un peu d’habitude.
Il est également possible de réaliser une fécondation in vitro en effectuant un broyat à partir de biopsies testiculaires dans un milieu de culture pour amphibien (MBS: Modified Barth’s Saline). Quelques gouttes de ce milieu de culture sont déposées sur les œufs. En appliquant sur la surface des oeufs, des fragments de biopsie testiculaire, la section du testicule libère des spermatozoïdes fécondants. Cette dernière méthode permet de conserver les fragments testiculaires plusieurs jours au réfrigérateur dans le milieu de culture. Les spermatozoïdes restant dans les tubes séminifères se conservent plus longtemps que dans la première méthode. Environ 10 minutes après l’application des spermatozoïdes, la coupelle est remplie de MBS 0.1X. L’avantage de cette technique réside dans le fait que l’on peut obtenir des lots d’œufs fécondés au même moment et qui se développent de manière synchrone.
Les femelles ayant pondu sont stockées dans un aquarium, à part des femelles prêtes à pondre. Il est recommandé de les marquer et d’enregistrer sur un répertoire d’élevage, la date de ponte, la quantité d’œufs produits, les pourcentages de fécondation et de développement. Ces données assurent la traçabilité des animaux. Une femelle ayant fourni des pontes en quantité et en qualité peut ainsi être suivie et remise à pondre tous les trois mois.
Attention ! La fécondation in vitro nécessite une biopsie du mâle. Bien qu’aisément réalisable sur un amphibien, une biopsie est cependant un acte chirurgical qui requiert légalement une habilitation. Celle-ci est accordée pour des laboratoires de recherche.
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