Embryogenèse Somatique In Vitro : Le Protocole Ultime pour Révolutionner la Biotechnologie Végétale

Introduction

L'embryogenèse somatique in vitro est un domaine fascinant de la biotechnologie végétale, offrant des perspectives considérables pour la multiplication et l'amélioration des plantes. Cette technique permet de générer des embryons à partir de cellules somatiques, c'est-à-dire des cellules non reproductrices, en contournant le processus de reproduction sexuée. Cet article explore en profondeur le protocole d'embryogenèse somatique in vitro, ses différentes étapes, ses applications et ses perspectives d'avenir.

La Micropropagation: Une Application Clé de la Culture In Vitro

La micropropagation est une application largement répandue de la culture de plantes in vitro. Ces techniques de culture de tissus sont utilisées pour multiplier des plantes génétiquement identiques (clones) de manière massive, dans des espaces réduits et sur une courte période, combinant les avantages des différents systèmes de reproduction végétale. Cette méthode de multiplication des plantes in vitro est l'une des techniques de culture en intérieur pour la biotechnologie végétale qui a pris une ampleur considérable ces dernières années, permettant d'obtenir des milliers de plantes identiques à partir de petits morceaux d'une plante mère, appelés explants. La réussite de la micropropagation dépend de la capacité à acclimater des plantes de qualité des conditions in vitro aux conditions ex vitro, pour produire de nouvelles plantes à partir des explants.

Aperçu Historique de la Culture de Tissus

L'histoire de la culture de tissus végétaux commence en 1902, lorsque le botaniste autrichien Gottlieb Haberlandt (1854-1945) standardisa les techniques de culture de cellules et de tissus végétaux dans le but d'atteindre la totipotence cellulaire (toutes les cellules végétales ont la capacité de se régénérer en plantes complètes). Haberlandt est aujourd'hui considéré comme le père de cette technique de culture.

En 1930, les hormones végétales furent introduites, permettant de guider le programme morphogénétique des cellules et ainsi produire des développements cellulaires organisés et désorganisés. En 1955, Miller découvrit les cytokinines, un des types d'hormones les plus importants dans la différenciation et la division cellulaire, et fondamentaux dans le processus d'organogenèse. À partir de 1960, Kanta réussit la propagation végétative d'orchidées sans virus par la culture de méristèmes apicaux. Quelques années plus tard, en 1962, Murashige et Skoog développèrent le milieu de culture MS, qui est actuellement le plus utilisé et le plus courant pour la culture in vitro de tissus végétaux. Le terme de micropropagation est défini pour la première fois en 1986 et est devenu une technique importante pour la sélection, le croisement et le contrôle des maladies végétales.

Étapes de la Micropropagation Végétale

La micropropagation commence avec l'objectif de cloner des plantes aux caractéristiques recherchées, de manière rapide et massive. Elle est composée d'étapes très différenciées, avec des objectifs parfaitement définis pour chacune d'entre elles. Il faut souligner que toute la matière végétale qui va être cultivée in vitro sera génotype-dépendante, chaque action ou protocole appliqué à la culture aura une réponse différente pour chaque génotype de plante.

Dans le processus de micropropagation, nous pouvons différencier plusieurs phases ou étapes composant le cycle complet de multiplication; cette méthode peut être appliquée à différentes espèces végétales, pouvant inclure des actions simples ou comprendre des étapes supplémentaires selon les caractéristiques de chaque plante, mais en général il s'agit des étapes les plus communes dans le processus de reproduction de plantes in vitro. Un bon exemple sont les espèces forestières ayant besoin d'une étape supplémentaire nommée endurcissement, réalisé avant la transplantation en pleine terre et après l'acclimatation ex vitro.

Sélection et Désinfection des Explants

Une fois les plantes mères sélectionnées, il est nécessaire de désinfecter superficiellement toute la matière végétale pour éviter l'apparition et le développement de micro-organismes indésirables ou de bactéries et champignons dans le milieu de culture. La sélection et la concentration des désinfectants, ainsi que le temps de désinfection sont principalement déterminés par les caractéristiques de l'explant; en pratique, on testera différentes combinaisons jusqu'à trouver le protocole idéal selon la matière traitée, toujours dans l'objectif d'éliminer les contaminants externes. Pendant cette étape, il s'agit de trouver un équilibre entre le processus de désinfection et infliger le moins de dégâts possibles à la matière végétale.

Introduction des Explants en Culture

L'objectif de cette phase est d'introduire les explants dans le milieu de culture par le moyen choisi. Selon celui-ci, nous parlerons de culture de méristèmes, de bourgeons, de protoplastes, d'anthères ou d'embryons. Ce travail est toujours réalisé dans une chambre à flux laminaire, pour éviter les contaminations indésirables. Une fois la matière végétale désinfectée, elle est introduite dans un milieu de culture stérile et l'on attend qu'elle forme de nouvelles pousses, ce qui prend généralement une à deux semaines.

Multiplication par Sous-cultures

Cette phase ou étape consiste à obtenir la plus grande quantité possible de masse végétale à partir de laquelle nous pourrons ensuite prélever de nouveaux explants. L'objectif est de favoriser une multiplication des explants suffisante pour la régénération du nombre de plantes nécessaires. Pour ce processus, sont utilisés des milieux de culture, régulateurs de croissance, cytokines acides gibbérelliques, pour faire s'enraciner ou régénérer de nouveaux tissus végétaux.

Enracinement In Vitro vs Ex Vitro

Comme son nom l'indique, le but de cette étape est de stimuler et favoriser la formation de racines chez les vitro-plants, un processus pouvant être mené in vitro ou ex vitro. Selon le type de culture et la facilité d'enracinement, nous devrons privilégier la culture in-vitro ou ex-vitro.

Acclimatation Ex Vitro

L'acclimatation permet aux plantes de s'adapter et vivre en conditions naturelles. Si l'enracinement a été fait ex vitro, l'acclimatation se fera en même temps. Au contraire, si l'enracinement a été fait ex-vitro il faudra acclimater les plantes aux conditions extérieures. Les plantes cultivées in vitro ont généralement des stomates non fonctionnels, il faudra donc soumettre les plantes à des périodes d'acclimatation pendant lesquelles nous réduisons l'humidité relative dans les tunnels jusqu'à obtenir des plantes avec un système racinaire opérationnel. Pendant cette phase, nous augmenterons progressivement l'intensité du système d'éclairage du tunnel. La réussite de la micro-propagation réside en grande partie du nombre de plantes que nous réussirons à acclimater!

Types de Micropropagation

La micropropagation repose sur la multiplication d'explants de forme massive en conditions contrôlées et stériles. Dans la culture in vitro nous pouvons utiliser différents types d'explants, avec chacun une fonction et un protocole différent. L'explant le plus utilisé dans les processus de multiplication in vitro sont les bourgeons végétatifs des plantes.

Il existe deux principales méthodes pour multiplier les plantes in vitro, l'organogenèse et l'embryogenèse.

Organogenèse: La Formation d'Organes

L'organogenèse est un processus consistant à obtenir des troncs, racines ou fleurs à partir d'un bourgeon. Cette méthode implique différents processus selon le type de tissus à régénérer, qu'il s'agisse de bourgeons ou de racines. L'organogenèse peut être directe (depuis l'explant) ou indirecte (depuis les durillons):

Organogenèse directe: il s'agit d'une réponse morphogénétique par laquelle se forment directement les organes, pour régénérer intégralement une plante complète.
Organogenèse indirecte: c'est une réponse morphogénétique par laquelle on cherche la formation d'organes à partir de la culture de durillons. La micropropagation à partir de durillons présente la possibilité de variation soma-clonale, et n'est donc pas très appréciée pour la multiplication de clones.

Embryogenèse: La Formation d'Embryons Somatiques

L'embryogenèse est un processus par lequel on recherche la formation d'embryons somatiques, qui prend aussi le nom d'embryogenèse asexuée ou adventice. Les embryons obtenus germent, donnant simultanément forme à un tronc et une radicule comme cela se passe avec une graine de cannabis lorsqu'elle germe. La réussite de l'embryogenèse somatique dépend de la variété introduite et de l'application de régulateurs de croissance, tout comme du milieu de culture. De même que pour l'organogenèse, l'embryogenèse peut être directe ou indirecte:

Embryogenèse directe: il s'agit d'un processus biologique par lequel les cellules somatiques développent des embryons. L'embryogenèse somatique est directe lorsque les troncs ou embryons sont directement produits à partir des tissus de départ.
Embryogenèse indirecte: implique la nécessité d'une induction pour que les cellules des explants utilisés se désordonnent et forment un durillon, avant de poursuivre la vie embryogénique au développement commun.

Embryogenèse Somatique : Protocole Détaillé

L'embryogenèse somatique consiste à produire des embryons somatiques à partir d'un explant de plante. Il existe deux types principaux d'embryogenèse somatique :

Embryogenèse somatique directe : Elle s'effectue directement à partir de cellules très jeunes. Un exemple est l'embryogenèse somatique directe sur un Nepenthes. On prélève une section de la plante située entre deux feuilles afin de stimuler le bourgeon présent.
Embryogenèse somatique indirecte : L'explant est prélevé sur une partie quelconque de la plante. Un cal (masse de cellules indifférenciées) se forme. Ce cal est ensuite mis sur différents milieux hormonés afin de diriger les cellules indifférenciées vers la formation d'une nouvelle plante.

Facteurs Influençant l'Embryogenèse Somatique

Plusieurs facteurs influencent l'embryogenèse somatique. Une thèse de doctorat de Yolande Roguet, dirigée par Yvette Dattée, a étudié l'embryogenèse somatique de la laitue pommée (Lactuca sativa L. S. S. P capitata) par culture in vitro. Cette étude a examiné l'influence de facteurs tels que les régulateurs de croissance, les solutions de vitamines, les sels minéraux et les conditions environnementales. Les résultats ont montré que les fragments de jeunes plantules et les embryons zymotiques matures forment les cals les plus embryogènes. L'étude a également optimisé la méthode d'embryogenèse somatique en examinant l'effet de la concentration en saccharose, des sources azotées et des traitements thermiques.

Protocole d'Embryogenèse Somatique de l'Olivier Picholine Marocaine

Des recherches ont été menées pour développer un protocole d'embryogenèse somatique pour l'olivier Picholine, un cultivar largement cultivé au Maroc. Les études ont examiné les effets de la composition du milieu de culture et de la lumière sur l'induction et le développement d'embryons somatiques. Après désinfection des noyaux d'olives Picholine, des cotylédons ont été mis en culture après suppression des embryons zygotiques. Ils ont été disposés en boîtes de Pétri soit entiers, soit en distinguant les parties proximales et distales. Pour la phase d'induction de cals embryogènes, quatre milieux de base [Murashige et Skoog (MS), Bourgin et Nitsch (BN), Schenk et Hildebrandt (SH) et Canas et Benbadis (OMc)], additionnés de régulateurs de croissance (zéatine et ANA), ont été testés soit à l'obscurité, soit en photopériode de 16 h. Après 6 semaines de culture sur ces milieux d'induction, les cals ont été transférés en tubes, dans des milieux de culture frais mais sans ANA et soumis à une photopériode de 16 h. À l'issue de cette phase, les plantules présentant des racines bien développées et au moins deux feuilles ont été repiquées dans des pots contenant un substrat et acclimatées en serre. Les meilleurs résultats d'induction et de développement des embryons somatiques ont été obtenus avec le milieu MS et aucune morphogenèse n'a été observée sur le milieu OMc. L'incubation à la lumière a significativement réduit l'induction des cals embryogènes et a inhibé la régénération des plantules. Les parties proximales des cotylédons ont donné de meilleurs résultats que les parties distales. Le taux de régénération de plantules a atteint 40% des explants mis en culture et le pourcentage de survie obtenu après leur acclimatation a atteint 94%. Le protocole décrit a démontré la capacité embryogène du cultivar Picholine marocaine.

Protocole d'Embryogenèse Somatique Secondaire du Citrange Troyer

Un protocole d'embryogenèse somatique secondaire et de régénération de plants de citrange Troyer a été mis au point. Des cals embryogènes ont été obtenus sur des hypocotyles de plantules, issues d'embryons nucellaires cultivés sur milieu de Murashige et Tucker (MT) dilué de moitié et enrichi en saccharose et en acide gibbérellique. Ils ont été transférés, ensuite, sur un milieu MT présentant une autre source de carbone (lactose ou galactose); des embryons somatiques ont été obtenus et leur formation s'est maintenue sur plusieurs cycles de culture. Une autre méthode d'embryogénèse a consisté à multiplier un stock de cals sur milieu MT, solide ou liquide, contenant du saccharose et de l'extrait de malt : des embryons somatiques secondaires ont été différenciés après transfert du cal sur un milieu MT contenant du lactose.

Applications de la Culture In Vitro

La culture in vitro d’explants ou de fragments prélevés sur la plante permet différentes applications :

La micro-propagation : Elle permet de reproduire un individu et le multiplier en très grand nombre, à partir de cellules ou d’un fragment d’organe. Elle se réalise par exemple à partir de nœuds, de pousses axillaires et s’apparente au bouturage des jardiniers. Mis en culture, ces tissus se développent et donnent une plante entière grâce à l’usage séquentiel de milieux nutritifs adaptés.
La culture de méristèmes : Les méristèmes sont formés de cellules non différenciées, à l’origine de tous les tissus de la plante. L’intérêt des méristèmes réside dans le fait que ce sont des structures indemnes de virus. Leur culture va permettre de régénérer des plantes saines. Un méristème est une zone de la plante où les cellules prolifèrent. On distingue sur le plan fonctionnel les méristèmes végétatifs, à l'origine de la fabrication des tiges, des feuilles, des racines et les méristèmes reproducteurs, à l'origine des fleurs (dans le cas où la fleur ou l'inflorescence est terminale, le méristème apical passe de l'état végétatif à l'état reproducteur. Dans le cas des méristèmes végétatifs, on distingue, en se basant sur leur localisation, leur mode de fonctionnement et leur implication dans le développement du végétal, des méristèmes primaires et secondaires. Le principal avantage de ce type de culture est d'obtenir des clones exempts de toute maladie.
L’obtention d’embryons somatiques : L’embryogénèse somatique est la production d’embryons à partir de cellules non germinales (par exemple cellules méristématiques) soumises à un traitement hormonal. Après cette induction, il se produit une multiplication des cellules suivie d’une différenciation progressive des embryons en culture.
Le sauvetage des embryons : Les embryons obtenus après la fécondation peuvent être prélevés, mis en culture in vitro et donner un nouvel individu. Le sauvetage d’embryons consiste à prélever un embryon précocement, à le cultiver in vitro, soit pour accélérer les cycles végétatifs, soit parce qu’il ne pourrait pas se développer dans les tissus maternels, par exemple lorsqu’il résulte d’un croisement interspécifique.
L’haplodiploïdisation : L’haplodiploïdisation consiste à obtenir des individus haploïdes doublés à partir de cellules reproductrices. Ces cellules germinales contiennent une seule copie du génome (cellules haploïdes) au lieu des deux présentes dans les cellules somatiques (cellules diploïdes). Au cours de la régénération de la plante, on obtient le doublement à l’identique du génome haploïde par application d’un composé chimique, la colchicine, extrait de la colchique.
L’obtention de protoplastes : Les protoplastes sont des cellules débarrassées de la paroi pectocellulosique par hydrolyse enzymatique. Ils peuvent être obtenus à partir de différents tissus d’une plante, de préférence des limbes de jeunes feuilles. Limités seulement par la membrane cytoplasmique, les protoplastes peuvent fusionner ce qui permet de créer de nouvelles variétés, d’introduire des caractères à hérédité cytoplasmique. Des plantes transgéniques peuvent être obtenues à partir de protoplastes transformés par électroporation. Cette méthode permet d’introduire de l’ADN nu (construction génique) dans les protoplastes par l’utilisation d’un champ électrique de haut voltage qui rend perméable leur membrane cytoplasmique.

Futur et Perspectives de la Culture In Vitro

Un des principaux défis de la micropropagation est la standardisation et le développement des processus et protocoles à suivre, afin d'atteindre le point de rentabilité de l'activité, en se faisant une place dans le marché grâce à son prix, le temps nécessaire et la qualité des produits obtenus. La robotisation est un autre facteur important pouvant influencer le prix final d'une plante cultivée in vitro, du fait que de nombreuses manipulations et processus demandent beaucoup de main d'œuvre humaine. Ainsi, automatiser le processus, ou au moins une partie, permettrait de réduire le coût d'une vitro-plante.

Les bioréacteurs sont également un grand pas réalisé dans la recherche sur la culture in vitro. Il existe différents types de bioréacteurs, ayant en commun leur fonction d'optimiser la multiplication de plantes de ce type de culture. L'objectif principal est d'automatiser et réduire les coûts de production, pour réduire la main-d'œuvre et obtenir des taux de multiplication supérieurs aux autres systèmes. Les bioréacteurs sont aussi caractérisés par l'utilisation de milieux de culture liquides ne nécessitant pas de gélifiant comme l'agar-agar. Enfin, les bio-fabriques sont des laboratoires de multiplication de plantes in vitro à grande échelle. Ces fabriques de vitro-plants sont caractérisées par leur processus de multiplication végétale parfaitement structuré. Le principal objectif d'une bio-fabrique est de suivre des protocoles parfaitement optimisés et standardisés afin d'obtenir une production de plantes maximale en un minimum de temps, d'espace et de coût. Actuellement, les bio-fabriques travaillent avec succès des espèces forestières, fruitières, aromatiques et ornementales.

tags: #embryogenèse #somatique #in #vitro #protocole

Embryogenèse Somatique In Vitro: Un Protocole Détaillé et Ses Applications