Introduction
La connaissance des événements moléculaires et cellulaires des premières étapes du développement de l’embryon des Mammifères est indispensable à la recherche biomédicale. Les mécanismes mis en jeu, parfois très spécifiques de cette période, font aussi l’objet de nombreuses recherches fondamentales. La souris a longtemps été utilisée comme modèle unique pour l’analyse de ces stades de développement. La souris domestique (Mus musculus) est un excellent modèle mammifère pour étudier une grande variété de caractères et de maladies, notamment ceux impliqués dans le développement.
La Souris : Un Modèle d'Étude Privilégié
La souris a été introduite comme modèle en génétique au début du XXème siècle, à la même époque que pour la drosophile. Dans une série d’articles de 1902 à 1905, Lucien Cuénot a utilisé des souris pour démontrer les lois de Mendel pour la première fois chez les mammifères. À peu près à la même période, William E Castle, un pionnier de l’utilisation de la drosophile pour étudier la génétique, a également commencé à étudier l’hérédité en utilisant comme phénotype la couleur du pelage chez la souris. Le laboratoire de Castle ainsi que d’autres ont lancé des programmes de recherche axés sur la génétique de la souris et ont rapidement réalisé la nécessité de créer des souches consanguines. En 1909, la première souche consanguine, DBA, a été créée et l’ère de la génétique de la souris moderne a commencé.
Synténie entre les Chromosomes Humains et Murins
L’organisation du génome a fortement divergé entre l’homme et la souris depuis leur ancêtre commun. Environ 180 cassures et réassemblages se sont produits dans les lignées humaine et murine. Bien que le nombre de chromosomes soit similaire chez les deux espèces (23 par génome haploïde chez l’homme contre 20 chez la souris), leurs structures globales diffèrent considérablement. Néanmoins, même après ce remaniement génomique important, il existe de nombreux grands blocs d’ADN dans lesquels l’ordre des gènes est le même chez l’homme et la souris. Dans un diagramme représentant l’ensemble des chromosomes humains, chaque partie de chaque chromosome est colorée en fonction du chromosome murin avec lequel elle est synténique. Les régions hétérochromatiques hautement répétitives (comme les centromères), difficiles à séquencer, ne peuvent être cartographiées correctement ; elles sont colorées en noir.
Étapes Précoces du Développement Embryonnaire
La souris est un excellent modèle pour étudier les étapes précoces du développement (clivage) et les étapes post-gastrulation. À E3,5, l’ensemble épiblaste/endoderme primitif s’appelle la masse cellulaire interne. À E4,5, le blastocyste de souris présente des populations cellulaires qui expriment des marqueurs spécifiques.
Période Préimplantatoire
La période préimplantatoire du développement des mammifères est cruciale. Véronique Duranthon a exploré la pertinence de la souris comme modèle pour cette période dans une publication de 2019.
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Lignage Cellulaire
Le lignage général de l’embryon de souris et de ses annexes est bien défini. Les cellules qui ne participent qu’à des annexes extraembryonnaires sont en vert, celles qui donneront des cellules des annexes et des cellules de l’embryon sont en hachurés verts. Le développement chez la souris, comme dans d’autres modèles, est de plus en plus étudié à l’échelle transcriptomique et cellulaire par scRNAseq (analyse transcriptomique sur cellules isolées). Les lignages de la souris entre E3,5 et E13,5 sont déduits des études de transcriptomiques sur cellules isolées (scRNAseq).
Culture d'Embryons In Vitro
Pour la période juste après l’implantation correspondant à la gastrulation, les embryons ont une taille et une topologie qui les rend difficiles à étudier dans l’utérus. Des techniques récentes de culture d’embryons in vitro ont permis de faire se développer des embryons de souris jusqu’à 11 jours après fécondation soit jusqu’à l’organogenèse ! Par traitement hormonal, on fait superovuler des souris femelles puis on les accouple avec un mâle. Les zygotes sont rapidement récupérés dans les voies génitales puis incubés in vitro. L’ADN d’intérêt, souvent un gène sous le contrôle d’un promoteur spécifique est injecté dans le pronucléus mâle. Puis on sélectionne les embryons qui ont poursuivi correctement leur développement et on les injecte dans l’utérus d’une femelle pseudo-gestante (la copulation provoque des stimuli mécaniques nécessaires au bon développement de l’utérus pour la gestation alors la femelle est préalablement accouplée avec un mâle vasectomisé). Les souriceaux nés doivent ensuite être sélectionnés pour la présence et l’expression du transgène. En effet, l’insertion du transgène dans le génome ne réussit pas à chaque fois et le transgène peut aussi très bien s’être inséré dans de l’hétérochromatine silencieuse. On effectue une RT-PCR ou alors un test qui permet de révéler l’expression d’un gène rapporteur s’il est présent dans le transgène (par exemple, coloration X-gal si on a mis le gène de la β-galactosidase).
Développement des Membres
Chez la Souris la formation d'un membre commence par un bourgeon qui apparaît sur le côté du corps. Ce bourgeon est constitué par des cellules mésodermiques recouvertes de cellules ectodermiques. Les cellules ectodermiques produisent des molécules qui stimulent les mitoses des cellules mésodermiques sous-jacentes. Le bourgeon s'allonge alors progressivement. Puis, dans une deuxième phase, les mitoses s'accélèrent près de l'extrémité postérieure, le bourgeon prend alors la forme d'une palette.
Techniques de Manipulation Génétique chez la Souris
Création de Souris Transgéniques
La création de souris transgéniques est un outil puissant en recherche. Par traitement hormonal, on fait superovuler des souris femelles puis on les accouple avec un mâle. Les zygotes sont rapidement récupérés dans les voies génitales puis incubés in vitro. L’ADN d’intérêt, souvent un gène sous le contrôle d’un promoteur spécifique est injecté dans le pronucléus mâle. Puis on sélectionne les embryons qui ont poursuivi correctement leur développement et on les injecte dans l’utérus d’une femelle pseudo-gestante (la copulation provoque des stimuli mécaniques nécessaires au bon développement de l’utérus pour la gestation alors la femelle est préalablement accouplée avec un mâle vasectomisé). Les souriceaux nés doivent ensuite être sélectionnés pour la présence et l’expression du transgène. En effet, l’insertion du transgène dans le génome ne réussit pas à chaque fois et le transgène peut aussi très bien s’être inséré dans de l’hétérochromatine silencieuse. On effectue une RT-PCR ou alors un test qui permet de révéler l’expression d’un gène rapporteur s’il est présent dans le transgène (par exemple, coloration X-gal si on a mis le gène de la β-galactosidase). Une version commentée de cette figure est disponible en vidéo.
Knock-out et Knock-in
L’introduction des mutations knock-out ou knock-in dans des souris est une technique clé. La mutation par recombinaison homologue est réalisée dans des cellules ES (embryonnaires souches) pluripotentes. Ces cellules sont injectées dans la masse cellulaire interne de blastocyste sauvage et l’embryon chimérique ainsi généré est transféré dans une mère porteuse. On obtient des souriceaux chimériques et certains d’entre eux ont leur lignée germinale formée à partir des cellules mutées (descendantes des cellules ES injectées dans les blastocystes). On croise ces souris avec des souris normales. A la génération suivante, la moitié des souris aura toutes leurs cellules hétérozygotes pour la mutation. On croise alors ces souris entre elles et un quart de leur descendance sera homozygote pour la mutation introduite.
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CRISPR/Cas9
La comparaison de la technique classique du knock-out/knock-in et de la technique CRISPR/Cas9 pour introduire une mutation chez la souris révèle des avantages significatifs pour la seconde. a) Génération d’allèles knock-out et knock-in à l’aide de la technologie des cellules souches embryonnaires (ES) chez la souris. Un clonage est nécessaire pour insérer dans un vecteur plasmidique la construction qui va remplacer le locus endogène. Ces vecteurs contiennent une cassette de sélection positive et négative. Le plasmide est ensuite électroporé dans les cellules ES puis il y a une sélection. Après vérification de la bonne insertion de la séquence, les cellules sont injectées dans un blastocyste, qui est ensuite transféré dans une femelle pseudogestante. Les descendants chimériques sont génotypés pour s’assurer que la construction attendue est correctement insérée dans le génome par recombinaison homologue. Les souris chimères devront se reproduire avec une souris sauvage pour produire des souris hétérozygotes qui, croisées entre elles, permettront de donner les mutants homozygotes. b) Génération d’allèles complexes à l’aide d’une édition améliorée du génome via la technologie d’administration d’acide nucléique dans l’oviducte (i-GONAD). Un ou deux ARN guide (sgRNA) sont conçus pour soit perturber un exon critique (knockout), soit supprimer un exon entier pour le remplacer par une séquence au choix (knockin). Les sgRNA sont synthétisés, ou transcrits in vitro, puis complexés avec le tracrRNA puis la protéine Cas9 pour former un complexe ribonucléoprotéique (RNP). Les RNP sont électroporés in situ dans l’oviducte d’une femelle gravide avec un long ADN simple brin qui servira de matrice à la réparation (ssODN). Les descendances sont génotypées pour vérifier l’édition réussie du gène d’intérêt. La deuxième procédure est nettement moins couteuse et nettement moins longue.
Système Cre-Lox
Le système Cre-Lox a permis de franchir cet obstacle en rendant possible une délétion d’un gène contrôlée spatio-temporellement au cours du développement. La Cre est une recombinase du bactériophage P1 qui est capable d’exciser toute séquence située entre deux séquences LoxP. Ici, l’activation de la Cre par un promoteur spécifique provoque la délétion d’un gène mais permet l’expression de la eGFP (une forme de la GFP à la fluorescence renforcée). En effet, dans la souris knock-in en haut à droite, la eGFP ne peut être exprimée car il y a un codon STOP entre le gène ciblé et elle. Grâce à l’action de la Cre dans les cellules où elle est exprimée dans les souris F1, non seulement le gène cible mais aussi ce codon STOP est éliminé. Cette méthode permet de repérer par fluorescence les cellules où le gène cible a été délété et de suivre leur devenir. Une version commentée en détails de cette figure est disponible en vidéo. Le système Cre-Lox peut aussi être utilisé pour faire du suivi de lignage cellulaire. L’activation d’un promoteur donné dirige l’expression de la Cre qui va réaliser la délétion d’une séquence générant un codon STOP qui empêche la production d’une protéine rapportrice fonctionnelle. Toutes les cellules qui ont activé le promoteur et aussi ses descendantes vont alors exprimer la protéine rapportrice.
Rôle de l'AVE dans la Formation de l'Axe Antéro-Postérieur
Une étape importante du développement embryonnaire est la mise en place des axes corporels. Chez les mammifères, le premier signe morphologique de la formation de l'axe antéro-postérieur dans l'embryon est la ligne primitive pendant la gastrulation à 6,5 (E6,5) jours de développement chez la souris. Lors de l'initiation de cet axe, des cellules extra-embryonnaires appelées AVE (Anterior Visceral Endoderm) jouent un rôle essentiel dans le positionnement de la ligne primitive dès E5,5. L'AVE sécrète des inhibiteurs des voies TGFβ/Nodal et Wnt qui repoussent alors la formation de la ligne primitive au pôle opposé. Plus récemment, des analyses de traçage cellulaire ont montré que les cellules AVE sont déjà spécifiées à E4,5 au moment de l'implantation, donc deux jours avant le début de la gastrulation (E6,5).
Nouvelles Approches : Embryons de Souris Synthétiques
Des chercheurs de l’Université de Virginie aux Etats-Unis sont parvenus à développer un embryon de souris à partir de cellules souches. L’embryon obtenu a un « cœur qui bat », et « ses muscles, ses vaisseaux sanguins, son intestin et son système nerveux commencent à se développer ». « Nous avons trouvé un moyen d’ordonner à des agrégats de cellules souches d’initier le développement embryonnaire », explique Christine Thisse, chercheur au département de biologie cellulaire de l’Université de Virginie. « En réponse à cette instruction contrôlée, les agrégats se développent en entités semblables à des embryons dans un processus qui récapitule les étapes embryonnaires une par une », précise-t-elle. Ainsi, les « structures sont organisées comme elles le devraient, autour de la notocorde (précurseur de la colonne vertébrale), un trait caractéristique des vertébrés ». Ce qui en fait « le modèle in vitro le plus sophistiqué de mammifère jamais créé » selon les chercheurs. Même s’il ne s’agit « pas encore » d’une souris « complète », des parties « essentielles » manquant encore, comme la partie antérieure du cerveau. « Avoir toute la variété de tissus fabriqués nous permet d’espérer que la communauté scientifique sera capable de construire des organes avec une bonne vascularisation, l’innervation et les interactions avec d’autres tissus », estime Christine Thisse.
Microscopie Avancée pour l'Imagerie Embryonnaire
Les méthodes d’imagerie traditionnelles ne permettent pas d'observer les premiers jours d'un embryon tout juste fécondé, car elles endommagent les tissus fragiles. Un instrument mis au point par une équipe de recherche offre une solution. Premier avantage : ce microscope à feuille de lumière laser permet de réduire la quantité de lumière nécessaire à l’observation. Il ajuste la mise au point à la milliseconde près, ce qui est important car un embryon bouge et grossit constamment. Grâce à ce microscope, l’équipe a pu filmer l’apparition et l’évolution de certaines catégories de cellules et cartographier l’expression de plusieurs gènes. La comparaison entre quatre embryons de souris révèle une grande similarité dans l'évolution d'un spécimen à l'autre. Au total, près d’un million d’images ont été enregistrées pour chaque embryon observé.
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