La chromatographie sur couche mince (CCM) est une technique analytique largement utilisée dans les laboratoires pour séparer, identifier et purifier les composants d'un mélange. Elle repose sur la séparation des composés en fonction de leurs affinités différentes pour une phase stationnaire (le support) et une phase mobile (l'éluant). Cet article détaille le protocole de CCM, les différents supports et éluants utilisés, les méthodes de révélation et les applications de cette technique.
Introduction
La chromatographie sur couche mince (CCM) est une des principales méthodes chromatographiques utilisées dans les laboratoires. Elle est employée dans divers domaines, allant de la séparation des couleurs d'un feutre à l'identification des acides aminés de l'aspartame. C'est une technique simple, rapide et peu coûteuse, ce qui en fait un outil précieux pour l'analyse qualitative et semi-quantitative.
Protocole Expérimental de la CCM
Le protocole de la CCM suit une série d'étapes précises pour garantir une séparation efficace et une analyse précise des composés.
Préparation de la Cuve et de l'Éluant
- Saturer la cuve : Introduire l'éluant jusqu'à une hauteur d'environ 0,5 cm dans la cuve à chromatographie, puis la fermer. Les vapeurs d'éluant vont alors saturer la cuve. Cette saturation est cruciale pour assurer une migration uniforme de l'éluant sur la plaque.
Préparation des Échantillons
- Dissolution des composés : Si les composés à analyser sont sous forme solide, les dissoudre dans un minimum de solvant. La concentration de l'échantillon est importante pour obtenir des taches bien définies.
Dépôt des Échantillons
- Dépôt des taches : Tracer au crayon un trait à 1 cm du bas de la plaque. C'est sur cette ligne que seront déposées les taches. Il est possible de fabriquer un applicateur in situ avec un tube en verre.
Développement de la Plaque
Placement de la plaque : Placer verticalement la plaque dans la cuve, et la refermer rapidement. Au départ, l'éluant ne doit pas toucher les dépôts.
Migration de l'éluant : SANS BOUGER LA CUVE, attendre que l'éluant soit arrivé à environ 1 cm du bord supérieur. La hauteur de la migration est un paramètre important pour la reproductibilité des résultats.
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Marquage du front de l'éluant : Retirer la plaque et tracer rapidement au crayon à papier un trait indiquant la hauteur atteinte par l'éluant.
Séchage de la Plaque
- Séchage: Laisser sécher la plaque.
Facteurs Influant sur la Séparation
La séparation des composés en CCM est influencée par plusieurs facteurs, notamment la nature du support, le choix de l'éluant et les interactions entre les composés, le support et l'éluant. Il est important de comprendre ces facteurs pour optimiser la séparation et obtenir des résultats fiables.
Nature du Support
Il existe trois principaux types de supports utilisés en CCM : la silice, l'alumine et la cellulose.
- Silice : C'est le support le plus courant. Il est conseillé de toujours commencer par celui-là. La silice est un support polaire, ce qui signifie qu'elle retient davantage les composés polaires.
- Alumine : L'alumine est également un support polaire, mais à caractère basique. Elle est souvent utilisée pour séparer les composés basiques.
- Cellulose : La cellulose est un support polaire, mais moins que la silice et l'alumine. Elle est utilisée pour séparer les composés très polaires, comme les sucres ou les acides aminés.
Choix de l'Éluant
Le choix de l'éluant est essentiel pour une bonne séparation. On a vu que le choix dépendait de la polarité. L'éluant doit être choisi en fonction de la polarité des composés à séparer et de la polarité du support. Les éluants peuvent être utilisés seuls ou en mélange, dans des proportions variées comme 100-0, 75-25, 50-50, 25-75, etc.
Interactions Moléculaires
Les interactions entre les composés, le support et l'éluant jouent un rôle décisif lors de la migration des composés. Ces interactions peuvent être de différentes natures, notamment les forces de Van der Waals, les interactions dipolaires et les liaisons hydrogène.
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- Forces de Van der Waals : Ces forces sont présentes entre toutes les molécules et contribuent à la rétention des composés apolaires sur le support.
- Interactions dipolaires : Ces interactions se produisent entre les molécules polaires et contribuent à la rétention des composés polaires sur le support.
- Liaisons hydrogène : Ces liaisons se forment entre les molécules contenant un atome d'hydrogène lié à un atome électronégatif (oxygène, azote, fluor) et contribuent à la rétention des composés polaires sur le support.
Révélation des Taches
La plupart des composés organiques sont incolores, il est donc nécessaire de les révéler pour les visualiser sur la plaque. Plusieurs méthodes de révélation peuvent être utilisées, en fonction de la nature des composés à détecter.
Lampe UV
Les dérivés aromatiques absorbent dans l'UV. Pour révéler ces composés, il suffit de placer la plaque sous une lampe UV et d'entourer les taches colorées au crayon.
Iode
L'iode forme des complexes colorés avec de nombreux composés organiques. Pour révéler les taches, placer la plaque et quelques cristaux d'iode dans une cuve fermée. Les taches apparaissent en jaune-marron en présence d'iode.
Pulvérisation de Réactifs
Certains réactifs chimiques réagissent avec les composés organiques pour former des produits colorés. Ces réactifs sont généralement utilisés en solution et pulvérisés sur la plaque. Il est important d'éviter toute formation de gouttelettes et d'appliquer le réactif en plusieurs pulvérisations. Un exemple de réactif est le réactif de molybdène en présence de sulfate de cérium.
Calcul du Rapport Frontal (Rf)
Le rapport frontal (Rf) est une valeur caractéristique de chaque composé dans des conditions de CCM données. Il est défini comme le rapport de la distance parcourue par le composé à la distance parcourue par l'éluant :
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Rf = (Distance parcourue par le composé) / (Distance parcourue par l'éluant)
Le Rf est une grandeur sans dimension, comprise entre 0 et 1. Il dépend du support, de l'éluant et de la température. Le Rf peut être utilisé pour identifier les composés en comparant sa valeur à celle de composés de référence.
Applications de la CCM
La CCM est une technique polyvalente qui peut être utilisée dans de nombreux domaines, notamment :
- Analyse de la pureté des composés : La CCM permet de vérifier la pureté d'un composé en détectant la présence d'impuretés.
- Identification des composés : La CCM permet d'identifier les composés en comparant leurs Rf à ceux de composés de référence.
- Suivi de réactions chimiques : La CCM permet de suivre l'évolution d'une réaction chimique en analysant les produits de réaction à différents moments.
- Séparation des composés : La CCM peut être utilisée pour séparer les composés d'un mélange en vue de leur purification.
- Analyse des produits naturels : La CCM est largement utilisée pour l'analyse des produits naturels, tels que les extraits de plantes et les huiles essentielles.
- Cartographie peptidique : Dans le cas d'un grand nombre de composés que l'on veut séparer, comme lors de l'hydrolyse d'une protéine, la CCM bidimensionnelle peut être utilisée. Dans un angle de la plaque, on réalise la tache. On laisse éluer dans un premier éluant. Après séchage, on fait tourner la plaque de 90° et on réalise une deuxième CCM avec un autre éluant. On obtient alors une cartographie de la protéine.
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