La chromatographie sur couche mince (CCM) est une technique analytique largement utilisée dans les laboratoires. Elle permet la séparation, l'identification et la purification des composés d'un mélange. C'est une méthode chromatographique d'adsorption basée sur la différence d'affinité existant entre les composés, la phase mobile et la phase stationnaire.
Principe de la chromatographie sur couche mince
Le principe de la CCM repose sur la séparation des composés d'un mélange en fonction de leurs interactions différentielles avec deux phases : une phase stationnaire et une phase mobile.
- Phase stationnaire : Il s'agit d'une couche mince d'adsorbant (généralement du gel de silice, de l'alumine ou de la cellulose) déposée sur un support plan, comme une plaque d'aluminium, de verre ou de plastique.
- Phase mobile : Il s'agit d'un solvant, ou d'un mélange de solvants, appelé éluant, qui migre par capillarité à travers la phase stationnaire.
La séparation des composés est basée sur l'équilibre entre l'adsorption des composés sur la phase stationnaire et leur solubilité dans la phase mobile. Les composés ayant une plus forte affinité pour la phase stationnaire migrent plus lentement, tandis que ceux ayant une plus forte affinité pour la phase mobile migrent plus rapidement. Ainsi, les différents constituants du mélange se séparent en fonction de leurs propriétés physico-chimiques. La vitesse d'entraînement des molécules dépend aussi de leur affinité avec l'éluant. De ce phénomène appelé rétention résulte que les constituants du mélange injecté se déplacent tous moins vite que la phase mobile et que leurs vitesses de déplacement sont différentes.
Interactions impliquées
Les interactions entre les composés, la phase stationnaire et la phase mobile sont de différentes natures :
- Forces de Van der Waals : Interactions faibles dues aux attractions dipolaires induites.
- Liaisons hydrogène : Interactions entre un atome d'hydrogène lié à un atome électronégatif (O, N, F) et un autre atome électronégatif. La phase stationnaire, comme la silice, peut interagir par des liaisons hydrogènes avec les composés. Ces interactions jouent un rôle décisif lors de la migration des composés. La silice peut agir comme donneur d'hydrogène (D).
- Interactions dipôle-dipôle : Interactions entre des molécules polaires.
- Interactions ioniques : Interactions entre des ions de charges opposées.
La polarité des composés joue un rôle important dans leur séparation. Les composés polaires ont tendance à interagir plus fortement avec les phases stationnaires polaires, tandis que les composés apolaires ont tendance à être davantage solubles dans les phases mobiles apolaires.
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Matériel utilisé en chromatographie sur couche mince
Le matériel nécessaire pour réaliser une CCM comprend :
- Plaques chromatographiques :
- Support : Les supports peuvent être en aluminium, en verre ou en plastique. La technique présentée ici utilise une phase stationnaire déposée sur une plaque d'aluminium.
- Phase stationnaire : Il existe trois principaux types de phases stationnaires :
- Silice : C'est le support le plus courant. Elle est polaire et convient à la séparation de composés apolaires à modérément polaires. Il est souvent conseillé de toujours commencer par la silice. La phase dite « normale » est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire et nécessite donc l'utilisation d'un éluant peu polaire (apolaire).
- Alumine : Elle est également polaire, mais moins que la silice. Elle est utilisée pour séparer des composés à caractère basique.
- Cellulose : Elle est polaire et est utilisée pour séparer les composés polaires, comme les sucres ou les acides aminés.
- Cuve de chromatographie : Récipient en verre, muni d'un couvercle, dans lequel la plaque est placée pour l'élution. On utilise un récipient haut (par exemple un becher) appelé "cuve". Les pots de "Blédine", présentant un rebord sur lequel on peut appuyer le haut de la plaque, permettent d'éviter les contacts avec les bords de la cuve.
- Éluant : Solvant ou mélange de solvants utilisé pour entraîner les composés à travers la phase stationnaire. Le choix de l'éluant est essentiel pour une bonne séparation. On dispose de deux cuves de chromatographie et de deux éluants.
- Capillaires : Tubes fins utilisés pour déposer les échantillons sur la plaque. L'étape importante de cette manipulation est le dépôt des espèces chimiques sur la plaque. On dépose à l'aide d'un capillaire les espèces à séparer, diluées dans un solvant, si possible identique à l'éluant ou suffisamment volatil, au niveau de la ligne de dépôt en réalisant des dépôts séparés de 1 à 2 cm entre eux et du bord de la plaque. Il est important de ne pas appuyer le capillaire sur la plaque afin de ne pas la creuser.
- Révélateurs : Substances chimiques utilisées pour visualiser les composés séparés, s'ils ne sont pas naturellement colorés ou fluorescents. Les huiles essentielles n'étant pas colorées, n'apparaissent pas sur la plaque : on doit utiliser un révélateur afin de repérer leur migration.
Choix de l'éluant
Le choix de l'éluant dépend de la polarité des composés à séparer et de la phase stationnaire utilisée. En général, on utilise un éluant de polarité similaire à celle des composés à séparer.
- Pour une phase stationnaire polaire (silice, alumine), on utilise un éluant apolaire ou modérément polaire (par exemple, hexane, acétate d'éthyle, dichlorométhane).
- Pour une phase stationnaire apolaire (phase inverse), on utilise un éluant polaire (par exemple, eau, méthanol, acétonitrile).
Il est possible d'utiliser des mélanges d'éluants de polarités différentes pour ajuster le pouvoir éluant du solvant. On peut utiliser des proportions variées comme 100-0, 75-25, 50-50, 25-75, etc.
Protocole opératoire de la chromatographie sur couche mince
La réalisation d'une CCM comprend les étapes suivantes :
- Préparation de la cuve :
- Verser l'éluant dans la cuve sur une hauteur d'environ 0,5 cm. On place environ 10 mL d'éluant dans la cuve à chromatographie, afin d'avoir un demi centimètre d'éluant au fond de celle-ci.
- Saturer la cuve en plaçant un papier filtre imbibé d'éluant contre les parois. Placer contre les bords de la cuve un morceau de papier filtre : l'éluant va monter par capillarité et assurera ainsi une meilleure saturation de la cuve. La saturation est nécessaire pour éviter l'évaporation de l'éluant pendant son ascension le long de la plaque. Rajouter un peu d'éluant si cela semble nécessaire. Fermer la cuve avec un couvercle. Introduire l'éluant jusqu'à une hauteur d'environ 0,5 cm dans la cuve à chromatographie, puis la fermer. Les vapeurs d'éluant vont alors saturer la cuve.
- Préparation de la plaque :
- Tracer au crayon un trait à environ 1 cm du bas de la plaque (ligne de dépôt). Sur une "plaque" constituée d'un support sur lequel est déposé l'adsorbant, adapté à la dimension de la cuve, on dépose une micro-goutte du corps à étudier et éventuellement des réactifs de référence. A environ un centimètre du bord de la plaque de chromatographie, tracez un trait fin au crayon, sans appuyer, afin de ne pas abîmer la couche d'adsorbant. Ce trait (ligne de base) servira de repère pour déterminer les longueurs de migration.
- Dépôt des échantillons :
- Déposer de petites quantités de chaque échantillon à séparer sur la ligne de dépôt, en veillant à ce que les taches soient bien séparées. L'étape importante de cette manipulation est le dépôt des espèces chimiques sur la plaque. On dépose à l'aide d'un capillaire les espèces à séparer, diluées dans un solvant, si possible identique à l'éluant ou suffisamment volatil, au niveau de la ligne de dépôt en réalisant des dépôts séparés de 1 à 2 cm entre eux et du bord de la plaque. Il est important de ne pas appuyer le capillaire sur la plaque afin de ne pas la creuser. Il est possible de répéter le dépôt plusieurs fois afin d'augmenter la quantité d'espèces chimiques déposées sans élargir les taches. Lorsque les composés à analyser sont sous forme solide, les dissoudre dans un minimum de solvant.
- Élution :
- Placer la plaque verticalement dans la cuve, en veillant à ce que la ligne de dépôt soit au-dessus du niveau de l'éluant. Au départ, l'éluant ne doit pas toucher les dépôts. Placer dans chaque cuve une plaque de chromatographie. Attention à ne pas mettre les bords latéraux de la plaque en contact avec la cuve : l'éluant monterait inégalement le long de celle-ci. Couvrir chaque cuve pour éviter l'évaporation de l'éluant. NE PLUS DEPLACER LA CUVE JUSQU'A LA FIN DE L'ELUTION.
- Laisser l'éluant migrer par capillarité jusqu'à une certaine hauteur (environ 1 cm du bord supérieur de la plaque).
- Retirer la plaque de la cuve et marquer rapidement au crayon la hauteur atteinte par l'éluant (front de solvant). Lorsque le front de solvant arrive à deux centimètres du haut de la plaque, on la retire et on repère immédiatement par un trait ce front, afin d'indiquer l'endroit où l'éluant est parvenu. Marquer rapidement au crayon le front du solvant (le méthanol s'évapore très vite).
- Révélation :
- Si les composés ne sont pas visibles à l'œil nu, utiliser un révélateur approprié pour les visualiser. Les huiles essentielles n'étant pas colorées, n'apparaissent pas sur la plaque : on doit utiliser un révélateur afin de repérer leur migration.
Méthodes de révélation
Plusieurs méthodes de révélation peuvent être utilisées, en fonction de la nature des composés à visualiser :
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- Observation sous lumière UV : Les dérivés aromatiques absorbent dans l'UV. Placer la plaque sous une lampe UV et entourer les taches colorées. On utilise une plaque de silice spéciale imbibée d'un agent qui devient fluorescent sous une radiation de longueur d'onde de 254 nm.
- Pulvérisation de réactifs chimiques :
- Iode : Les composés organiques apparaissent sous forme de taches jaune-marron en présence d'iode. Placer la plaque et quelques cristaux d'iode, puis boucher.
- Ninhydrine : Révèle les acides aminés (taches violettes).
- Acide sulfurique : Après chauffage, révèle la plupart des composés organiques (taches noires).
- Réactif de molybdène en présence de sulfate de cérium. Appliquer en plusieurs pulvérisations en évitant toute formation de gouttelettes. Ce révélateur est pulvérisé sur la plaque de chromatographie. La pulvérisation doit être légère pour ne pas laver la plaque.
- Chauffage : Certaines substances deviennent visibles après chauffage de la plaque.
Calcul du rapport frontal (Rf)
Le rapport frontal (Rf) est une valeur caractéristique de chaque composé dans des conditions chromatographiques données. Il est défini comme le rapport de la distance parcourue par le composé à la distance parcourue par le front de solvant :
Rf = (Distance parcourue par le composé) / (Distance parcourue par le front de solvant)
Marquer les fronts de migration des différents constituants puis calculer les rapports frontaux.
Le Rf est une grandeur sans dimension, comprise entre 0 et 1. Il dépend de la nature du composé, de la phase stationnaire, de l'éluant et de la température. Dans des conditions opératoires données, le "temps de rétention" (temps au bout duquel un composé est élué de la colonne et détecté), caractérise qualitativement une substance.
Applications de la chromatographie sur couche mince
La CCM est une technique polyvalente qui trouve de nombreuses applications dans différents domaines :
Lire aussi: CCM : Guide complet
- Chimie organique :
- Suivi de réactions chimiques
- Contrôle de la pureté de composés organiques. Lorsque les conditions opératoires sont connues, la CCM permet un contrôle aisé et rapide de la pureté d’un composé organique.
- Identification de composés
- Biochimie :
- Séparation d'acides aminés, de lipides, de sucres, etc.
- Analyse de médicaments et de toxines
- Pharmacie :
- Contrôle qualité de médicaments
- Identification de principes actifs
- Agroalimentaire :
- Analyse de colorants alimentaires
- Détection de pesticides
- Environnement :
- Analyse de polluants dans l'eau et le sol
Exemples d'applications spécifiques
- Séparation des couleurs d'un feutre.
- Identification des acides aminés de l'aspartame.
- Extraction et chromatographie des colorants d'une feuille de Prunus.
- Extraction et chromatographie d'huiles essentielles de feuilles de Menthe poivrée. La menthe poivrée a été choisie car l'extraction produit une quantité importante d'huiles essentielles, ce qui facilite la séparation des deux phases.
- Analyse de l'hydrolyse d'une protéine. Dans ce cas, on réalise une CCM bidimensionnelle pour séparer un grand nombre de composés. On laisse éluer dans un premier éluant, puis dans un deuxième éluant après rotation de la plaque de 90 degrés. On obtient alors une cartographie de la protéine.
- La chromatographie de l'huile essentielle de menthe poivrée fait apparaître au moins six composants, dont les plus importants sont le menthol, la menthone et le cinéole.
Avantages et inconvénients de la chromatographie sur couche mince
La CCM présente plusieurs avantages :
- Simplicité et rapidité : La technique est facile à mettre en œuvre et ne nécessite pas d'équipement sophistiqué. La durée de l'élution est d'environ 10 minutes.
- Faible coût : Le matériel utilisé est peu coûteux.
- Polyvalence : Elle peut être appliquée à une grande variété de composés.
- Sensibilité : Elle permet de détecter de faibles quantités de composés. Nous avons vu que la technique de CCM est une technique fiable et rapide. Ceci explique son emploi très fréquent dans les laboratoires.
Cependant, la CCM présente également quelques inconvénients :
- Résolution limitée : La séparation des composés peut être moins bonne qu'avec d'autres techniques chromatographiques (par exemple, chromatographie en phase liquide haute performance, HPLC).
- Difficulté de quantification : La quantification précise des composés séparés est difficile.
- Technique semi-quantitative
Autres techniques chromatographiques
Outre la CCM, il existe d'autres techniques chromatographiques, telles que :
- Chromatographie sur colonne : Technique préparative permettant de séparer et de purifier de grandes quantités de composés.
- Chromatographie en phase liquide (HPLC) : Technique analytique et préparative offrant une meilleure résolution et une quantification plus précise que la CCM.
- Chromatographie en phase gazeuse (CPG) : Technique utilisée pour séparer et analyser des composés volatils. Le principe de la séparation par CPG consiste à partager l'échantillon à analyser entre deux phases. Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un intégrateur permet d'obtenir un tracé appelé chromatogramme. Il permet de mettre en évidence le passage des différents gaz séparés par la colonne.
- TCD (détecteur à conductibilité thermique) : Il est basé sur la mesure des variations de conductibilité thermique des mélanges gazeux en fonction de leur composition.
- FID (détecteur à ionisation de flamme) : C’est un détecteur beaucoup plus sensible que le catharomètre, mais il ne donne de réponse qu’aux composés organiques.
Composants d'un système HPLC
- La pompe : elle est munie d'un système de gradient permettant d'effectuer une programmation de la nature du solvant.
- Vanne d'injection : c'est un injecteur à boucles d’échantillonnage. Il existe des boucles de différents volumes, nous utilisons généralement au laboratoire une boucle de 20µl.
- Colonne : La phase normale est constituée de gel de silice (polaire, éluant apolaire). La phase inverse est composée de silice greffée par des chaînes linéaires de carbones (apolaire, éluant polaire).
- Détecteur UV-visible : il mesure l'absorption de la lumière par le produit à la sortie de la colonne. Le détecteur à barrette de diodes permet d’obtenir un domaine de longueurs d’onde simultanément.
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