Introduction
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un petit poisson d'eau douce originaire du sud-est de l'Himalaya. Il est devenu un organisme modèle de plus en plus populaire dans la recherche scientifique, en particulier dans les domaines du développement embryonnaire, de la génétique et de la médecine régénérative. Ses caractéristiques uniques, telles que la transparence de ses embryons, sa capacité à régénérer des tissus et organes, et la similitude de ses gènes avec ceux de l'homme, en font un outil précieux pour les chercheurs du monde entier. En Inde, une quinzaine de laboratoires étudient le poisson zèbre afin de découvrir si le comportement de ses cellules peut être extrapolé aux autres organismes.
Caractéristiques du poisson-zèbre
Le poisson-zèbre appartient à la famille des Cyprinidés et vit dans les eaux douces de l’Inde et du Bangladesh. Un poisson-zèbre adulte mesure environ 2,5 cm de long. Son utilisation en recherche a été popularisée dans les années 1970 par Georges Streisinger de l’Université d’Oregon (Etats-Unis). Le poisson-zèbre est omnivore et vit environ 5 ans en laboratoire. Son cycle de vie est de 90 jours, ce qui permet d'avoir une nouvelle génération tous les 3 mois.
Développement embryonnaire du poisson-zèbre
L'embryon du poisson-zèbre se développe dans l'eau, ce qui en fait un sujet d'étude idéal pour les chercheurs. "L’embryon se développe à l’extérieur du corps de la mère et comme il est transparent il est très facile de l’étudier au microscope", explique Rakesh Mishra, directeur du Centre de biologie moléculaire et cellulaire, à Hyderabad (CCMB). La transparence rend également les techniques de manipulation génétique plus faciles à utiliser. Le poisson zèbre peut fournir jusqu’à 200 embryons en une seule fois, et il est prêt à en produire d’autres très rapidement.
Les premières divisions cellulaires
Filmer le développement embryonnaire de grenouilles ou de poissons n’est pas une nouveauté. Depuis plusieurs années, diverses techniques d’imagerie des cellules, telle la microscopie à deux photons, permettent même d’obtenir des images des profondeurs de l’embryon. Toutefois, aucune des techniques utilisées jusqu’à présent n’offre une résolution ou une cadence d’images suffisantes pour suivre l’évolution de chaque cellule de l’embryon au fil de ses divisions. Leur microscope a été optimisé pour visualiser simultanément deux types de signaux, émis par certaines structures cellulaires en raison de leurs propriétés optiques intrinsèques, lorsqu’elles sont éclairées par un faisceau laser. L’un, nommé signal de génération de deuxième harmonique, est émis par les structures denses ne présentant pas de centre de symétrie, tels les faisceaux de microtubules du fuseau mitotique, ces rails qui guident les chromosomes lors de la division cellulaire. Grâce à un traitement informatique, les chercheurs ont pu enregistrer les mouvements des cellules, les temps caractéristiques de leurs divisions, et étudier en détail la géométrie de la multiplication cellulaire chez l’embryon. Ils ont notamment observé que, dès le stade à deux cellules, les divisions cellulaires ne sont plus synchrones : elles s’étalent de plus en plus dans le temps, formant des vagues de divisions traversant tout l’embryon, comme le montrent deux projections des fuseaux mitotiques des cellules, structures qui apparaissent toujours à la même étape de la division et en constituent donc un repère temporel (en vert).
Le bouclier embryonnaire
Le bouclier embryonnaire de l’embryon du poisson-zèbre est indiqué sur une vue latérale (A) ou une vue depuis le pôle animal (B) par deux têtes de flèches sur un embryon de poisson-zèbre de 6 heures après la fécondation. Il s’agit de l’homologue de l’organisateur de Spemann et du noeud de Hensen, responsable de l’induction neurale et de la dorsalisation du mésoderme.
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Carte des territoires présomptifs
L’embryon en tant que tel se développe sous la forme d’un dôme posé sur le vitellus. CNS = système nerveux central; PPE = ectoderme pré-placodal; NC = crêtes neurales; yolk = vitellus.
Mésoderme
Hybridation in situ fluorescente avec des sondes qui reconnaissent l’ARNm de tbxta (ou brachyury), un marqueur du mésoderme chordal et l’ARNm de tbx16, un marqueur du mésoderme paraxial.
Avantages du poisson-zèbre comme modèle expérimental
Le poisson-zèbre présente de nombreux avantages en tant que modèle expérimental :
- Petite taille et facilité d'élevage: Le poisson-zèbre est facile à maintenir en laboratoire et se reproduit rapidement.
- Embryons transparents: La transparence des embryons permet d'observer le développement des organes et des tissus en temps réel.
- Manipulation génétique facile: Il est relativement facile de modifier le génome du poisson-zèbre, ce qui permet d'étudier la fonction des gènes.
- Homologie génétique avec l'homme: 70 % des gènes présents chez l'Homme trouvent un équivalent chez cette espèce tropicale.
- Capacité de régénération: Le poisson-zèbre possède l'extraordinaire capacité de régénérer certains de ses organes et tissus, ce qui en fait un modèle intéressant pour la recherche en médecine régénérative.
Applications de la recherche sur le poisson-zèbre
La recherche sur le poisson-zèbre a de nombreuses applications potentielles, notamment :
- Compréhension du développement embryonnaire: Le poisson-zèbre permet d'étudier les mécanismes fondamentaux du développement embryonnaire, ce qui peut aider à comprendre les malformations congénitales chez l'homme.
- Identification de gènes impliqués dans les maladies: Le poisson-zèbre peut être utilisé pour identifier des gènes impliqués dans les maladies humaines, ce qui peut conduire à de nouvelles thérapies.
- Développement de médicaments: Le poisson-zèbre peut être utilisé pour tester l'efficacité et la toxicité de nouveaux médicaments.
- Médecine régénérative: La capacité du poisson-zèbre à régénérer des tissus et des organes pourrait être exploitée pour développer de nouvelles thérapies pour les maladies dégénératives et les lésions traumatiques chez l'homme. Plusieurs laboratoires indiens rêvent de reproduire chez l’humain les propriétés autoréparatrices du poisson zèbre. L’être humain ne peut réparer seul ses muscles lésés contrairement à son cousin vertébré Danio rerio. Plus connu sous le nom de poisson zèbre, il peut remettre à neuf pratiquement tous ses organes, y compris le cœur, la colonne vertébrale, le foie, le pancréas et les reins.
Régénération de la nageoire caudale
Le poisson-zèbre possède l'extraordinaire capacité de reconstituer sa nageoire. Des chercheurs tentent de comprendre le processus, ouvrant ainsi des pistes pour les progrès de la médecine régénérative. Espoir pour les personnes atteintes d'arthrose ? Le Danio rerio, plus communément appelé poisson-zèbre, possède l'extraordinaire capacité de régénérer sa nageoire caudale (de la queue) lorsque celle-ci a été amputée. Ce phénomène est rendu possible par la formation d'un blastème, un groupe de cellules qui amorce et contrôle la régénération du tissu. Mieux les comprendre et décrypter leurs interactions, c'est ouvrir la voie à une meilleure compréhension de ce processus afin d'envisager, à terme, des recherches cliniques sur l'Homme. C'est à cette tâche passionnante que se sont attelés des scientifiques de l'Inserm et de l'Université de Montpellier.
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Jusqu'à présent, seules quelques cellules du blastème avaient été décrites, et les mécanismes biologiques sous-jacents demeuraient mal documentés. Les dernières recherches, menées par Farida Djouad, directrice de recherche à l'Inserm, soulignaient le rôle inédit des macrophages, cellules du système immunitaire, lors de la formation du blastème. Dans cette nouvelle étude, les chercheurs ont révélé l'implication majeure d'une population cellulaire dérivée de la « crête neurale ». Ces cellules sont présentes chez tous les vertébrés et jouent notamment un rôle clé dans le développement de l'embryon. Chez le poisson-zèbre, « elles orchestrent le processus de régénération en dialoguant avec les macrophages et les autres cellules du blastème afin de contrôler et de réguler leur réponse, révèle l'Inserm. Ce dialogue se fait notamment via un facteur clé appelé NRG1 (gène Neuregulin 1).
Pourquoi les mammifères, qui possèdent aussi des macrophages et des cellules dérivées de la crête neurale, ne parviennent pas à régénérer leurs appendices comme le poisson-zèbre ? Cette question sera au cœur de la prochaine étude. « Nous continuons ces travaux sur d'autres modèles de vertébrés, notamment la souris, afin de mieux comprendre à quel moment du développement embryonnaire les mammifères perdent cette capacité de régénération, et pour quelle raison », explique Farida Djouad. L'objectif : identifier « LA » cellule chef d'orchestre, commune à tous les processus de régénération afin de le promouvoir puis le transposer dans le traitement de maladies dégénératives telles que l'arthrose.
Xénotransplantation de cellules tumorales
Des cellules cancéreuses humaines marquées avec un colorant fluorescent rouge ou vert sont injectées à l’aide d’une micropipette en verre ou d’une aiguille capillaire en verre dans le sac vitellin d’embryons de poisson-zèbre 2 jours après la fécondation. Les embryons xénogreffés sont ensuite maintenus à une température spécifique comprise entre 28 et 37 °C. Après 2 à 7 jours après l’injection, on observe que le nombre de cellules tumorales augmente et que certaines cellules se disséminent sur des sites éloignés tels que la tête et la queue. Selon les gains et les perte-de-fonction que l’on réalise dans ces cellules au préalable, on peut tester le rôle de protéines d’intérêt dans la prolifération et la migration cellulaire.
Criblage de perturbateurs endocriniens
L'embryon de poisson zèbre est devenu un modèle vertébré alternatif essentiel à l'expérimentation animale pour l'évaluation des dangers et des risques environnementaux des produits chimiques. Le modèle d'embryon de poisson zèbre a suscité un intérêt supplémentaire grâce au développement de modèles transgéniques et à leur utilisation pour évaluer les perturbateurs endocriniens (PE). Parmi eux, le test EASZY a été conçu pour détecter et quantifier l'activité œstrogénique des produits chimiques agissant par l'intermédiaire des récepteurs des œstrogènes (ER) par mesure de l’induction de la GFP sous le contrôle du gène cyp19a1b (aromatase cérébrale). Ce test, pour lequel une ligne directrice a récemment été adoptée (TG N°250) est considéré comme un test de niveau 3 du cadre conceptuel de l’OCDE pour les PE. Cependant, il ne permet pas de renseigner des conséquences toxicologiques induites par une perturbation de l’expression de l’aromatase B. Ce lien entre un mécanisme d’action donné et des effets néfastes potentiels sur les organismes est cependant indispensable pour pouvoir utiliser les données du test EASZY dans l’évaluation des risques des PE. Les travaux de cette thèse ont permis tout d’abord de raffiner un test règlementaire, le test FET de toxicité, à l’aide de la lignée cyp19a1b-GFP de poisson zèbre. Ce raffinement a permis de proposer une stratégie de test qui repose sur la combinaison de deux tests règlementaires (le test FET et le test EASZY). Cette stratégie permet d’évaluer, efficacement, les dangers des substances en apportant des informations nouvelles sur leurs toxicités et/ou leurs activités oestrogéniques. Les données collectées sur le test EASZY et la comparaison avec des tests in vitro et in vivo du cadre conceptuel de l’OCDE pour les PE nous permet de mieux cerner la place du test EASZY parmi un ensemble de tests. Les résultats obtenus dans l’étude de la cinétique de perturbation de l’aromatase B ont permis d’obtenir des informations nouvelles concernant l’émergence de la signalisation oestrogénique et sa perturbation. Ces expériences ont également permis de produire un ensemble d’échantillons qui serviront à alimenter un modèle PBPK chez l’embryon de poisson afin d’améliorer l’évaluation des risques des substances. Ces approches ont été complétées par la réalisation de tests comportementaux chez les embryons afin d’informer des effets indésirables potentiels des substances agissant sur l’aromatase cérébrale. Les résultats obtenus ici ne permettent pas à eux seuls d’établir un lien entre la perturbation de l’aromatase cérébrale et des effets comportementaux.
Techniques de manipulation génétique chez le poisson-zèbre
Le poisson-zèbre est un outil génétique puissant et près de 30.000 allèles sont connus et répertoriés par le ZIRC (Zebrafish International Research Center). On peut faire facilement des lignées transgéniques chez le poisson zèbre.
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Poisson-zèbre transgénique avec un gène rapporteur
Par microinjection dans un zygote de poisson-zèbre, on introduit une construction d’ADN comportant un gène rapporteur (codant la d2EGFP, une forme de la GFP qui la rend rapidement dégradable pour mieux étudier la dynamique de son expression) sous le contrôle d’un promoteur minimal et d’une succession de séquences (BS = binding sites) qui peuvent interagir avec LEF/TCF, des facteurs de transcription activés par la β-caténine lorsque la voie Wnt est activée. Une autre lignée transgénique est générée avec des sites de fixation de LEF/TCF mutés qui sert de contrôle négatif. Au bout de 30 heures, on observe de la fluorescence verte dans les régions de l’embryon où la voie Wnt est active. Il n’y a presque pas de signal fluorescent dans la lignée avec la mutation (juste un peu d’autofluorescence notamment dans le vitellus). dmb : mésencéphale dorsal, ov : vésicule otique, mff : pli de la nageoire médiane, pfb : bourgeon de la nageoire pectorale. Barre d’échelle = 200 μm.
Étude perte-de-fonction avec un morpholino (MO)
Des embryons de poisson-zèbre de 4 jours sont observés en vue latérale et traités en immunohistochimie avec un anticorps anti-αHu qui reconnait les neurones. Chez des embryons non injectés (à gauche) on observe bien les ganglions rachidiens répétés le long de l’axe antéro-postérieur alors que dans des embryons injectés avec 1,5 ng d’un morpholino inhibant la production de Neurogénine-1, les ganglions ne sont plus présents.
Le génome du poisson-zèbre
Le génome du poisson-zèbre a été entièrement séquencé en 2009. Il fait 1,4 milliards de paires de bases et il contient 26.000 gènes. Le CCMB est en train d’étudier la fonction des gènes Hox responsa.
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