Introduction
L'étude du développement embryonnaire chez les amphibiens, particulièrement à partir d'un œuf non fécondé, offre un aperçu fascinant des mécanismes fondamentaux de la biologie du développement. Les œufs d'amphibiens, notamment ceux des espèces Xenopus laevis et Xenopus tropicalis, sont devenus des modèles de choix pour les chercheurs en raison de leur grande taille, de leur accessibilité et de la facilité avec laquelle leur développement peut être manipulé et observé. Cet article explore les différentes facettes du développement embryonnaire des amphibiens, en mettant l'accent sur les caractéristiques de l'œuf non fécondé, les étapes clés du développement et les techniques utilisées pour étudier ce processus.
Caractéristiques de l'Œuf Non Fécondé d'Amphibien
L’œuf vierge d’Amphibien Anoure ou Urodèle est une cellule arrondie de deux millimètres de diamètre. Au sortir de la femelle, les œufs non encore fécondés présentent des régions pigmentées et blanches correspondant respectivement à l’hémisphère animal et à l’hémisphère végétatif. La disposition aléatoire des œufs les montre sous leurs différents aspects.
Structure de l'œuf
Chaque œuf est divisé en deux grandes parties :
- L'ovocyte : Il contient la cellule reproductrice femelle ou gamète femelle. L’ovocyte est une grande cellule divisée en deux pôles : vers le haut le pôle marron (pôle animal) et vers le bas, le pôle blanc (pôle végétatif).
- La gangue gélatineuse protectrice : Elle entoure l'ovocyte.
Composition de l'ovocyte
- Pôle végétatif : Il est en bas car il est le plus lourd. Il contient beaucoup de réserves, les plaques vitellines. On a au sein de l’ovocyte un gradient vitellin : les plaquettes vitellines sont de plus en plus grosses et abondantes à mesure qu’on va vers le pôle végétatif.
- Pôle animal : Il est de couleur marron, car il est fortement pigmenté par de la mélanine. On a au sein de l’ovocyte un gradient ribonucléoprotéique : ARN, protéines et ribosomes d’autant plus abondants qu’on s’approche du pôle animal. Ces ARN vont permettre la synthèse de nombreuses protéines au cours des premières étapes du développement.
Sous le plasmalemme (membrane plasmique) de l’œuf non fécondé, le cytoplasme cortical ne contient pas de plaquettes vitellines. Les granules corticaux sont d’origine golgienne ; ils sont absents chez les Amphibiens Urodèles. Les pigments sont répartis suivant une intensité qui diminue souvent chez certaines espèces, dans l’hémisphère végétatif. Le cytoplasme interne est hétérogène, résultat d’une répartition inégale des produits de synthèses élaborés pendant l’ovogenèse. Schématiquement, des ARN stables se répartissent suivant un gradient décroissant du pôle animal au pôle végétatif. A l’inverse, des réserves lipidiques, protéiques et glucidiques formant notamment des plaquettes vitellines suivent un gradient de taille croissante du pôle animal au pôle végétatif et de la périphérie de l’œuf vers le centre, de sorte que le hyaloplasme est peu abondant dans l’hémisphère végétatif.
Étapes Clés du Développement Embryonnaire
Fécondation et orientations initiales
Une demi-heure après la fécondation, l’œuf de xénope s’oriente en fonction de la pesanteur. L’hémisphère végétatif, plus dense, s’oriente vers le bas, laissant apparaître à l’observateur l’hémisphère animal pigmenté. Au centre de la tache de maturation, un point pigmenté marque l’emplacement où sont expulsés les globules polaires. Le second globule polaire est émis après la pénétration du spermatozoïde, la tache de maturation disparaît par contraction du cytosquelette du feuillet pigmentaire cortical.
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Après la réaction corticale, la plasmalemme est libérée du contact avec la membrane vitelline devenue la membrane de fécondation. L’œuf s’équilibre selon les lois de la pesanteur, le pôle végétatif plus lourd s’oriente vers le bas. Cette rotation d’équilibration s’achève en 30 minutes et intéresse la totalité de la masse de l’œuf.
Formation du croissant gris et acquisition du plan de symétrie
1 heure 10 après la fécondation, un déplacement de cytoplasme superficiel comprenant la couche pigmentaire s’effectue suivant un mouvement de bascule d’une ampleur d’environ 30 degrés, autour d’un axe passant par le centre de l’œuf, et orthogonal à un plan déterminé par l’axe P.A.-PV. et la traînée spermatique. Le sens du déplacement est tel que le pigment descend vers le PV. du côté correspondant au point de pénétration du spermatozoïde et remonte vers le P.A. du côté opposé. La zone de remontée a une forme de croissant de teinte grisâtre due à du pigment resté sur place, le croissant gris. C’est dans le plan défini par P.A.-PV. et traînée spermatique que la remontée du pigment est à son maximum. Ce plan constitue le plan de symétrie de l’embryon et le croissant gris sa région dorsale.
Chez le xénope, ce mouvement est dirigé par le spermaster qui se développe, lors de la pénétration du spermatozoïde, dans le cytoplasme de l’hémisphère animal autour du centriole spermatique et qui suit la migration du pronucléus mâle. Après la fusion des pronucléi mâle et femelle au centre de l’hémisphère animal, le cortex dorsal se contracte en direction du point d’entrée du spermatozoïde, entraînant un retrait dans la partie dorsale. Le sens de ce mouvement du cortex dorsal est sans doute induit par les interactions entre les microfilaments du cortex dorsal et les microtubules du spermaster qui sont largement développés. Des mouvements cytoplasmiques plus profonds créent aussi dans le vitellus une dissymétrie avec remontée d’un mur vitellin dorsal (Ubbels et al.). Chez les Urodèles qui sont polyspermiques, on ne connaît pas de relation entre croissant gris et pénétration du spermatozoïde.
Segmentation
Environ 2h30 après la fécondation, le premier plan de clivage de la première mitose apparaît. Il partage la cellule-œuf en deux premières cellules de taille identique. Le second plan de clivage apparaît 20 à 25 minutes après le premier plan de clivage et perpendiculairement à celui-ci. Par la suite, les plans de clivage se succèdent et découpent le volume de l’œuf fécondé en plusieurs centaines de cellules. La durée de la segmentation varie avec les espèces. Chez l’axolotl, un Urodèle, le premier sillon de segmentation qui sépare les deux premiers blastomères apparaît 2h30 après la fécondation et coïncide dans 50 % des cas avec le plan de symétrie bilatérale de l’embryon.
Après une seconde division suivant un plan méridien perpendiculaire au premier et une troisième sus-équatoriale, les blastomères commencent à s’écarter sur leur face interne pour délimiter un blastocèle qui occupera surtout l’intérieur de l’hémisphère animal. Les 2 plans de division suivants sont méridiens et forment un angle de 45° avec les deux premiers. Les divisions sont d’abord synchrones pendant onze cycles, chaque cycle, dépourvu de phase G1, dure 70 minutes. Ce rythme se ralentit et les divisions deviennent asynchrones, avec allongement de G2 et apparition de G1, après le 11ème cycle qui correspond à la transition blastuléenne ou mi-blastula. Le ralentissement est plus marqué dans l’hémisphère végétatif. La chronologie est différente chez le xénope, avec des cycles de 35 minutes et une mi-blastula atteinte à la 9e heure de segmentation.
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Gastrulation
Dans cet œuf hétérolécithe, la totalité des cellules contenant des inclusions vitellines est concernée par les mouvements morphogénétiques. Une zone d’invagination cellulaire ou blastopore se situe sous l’emplacement du croissant gris dont les limites se sont estompées pendant la segmentation. C’est d’abord un sillon incurvé, horizontal, la lèvre dorsale du blastopore qui évolue tandis que les tissus mésodermique et endodermique pénètrent dans la cavité de segmentation et forment une seconde cavité qui s’y emboîte, l’archentéron.
La lèvre blastoporale s’incurve, avec son prolongement par les lèvres latérales, puis se referme en un cercle avec l’apparition de la lèvre ventrale du blastopore, entourant le bouchon vitellin constitué par les cellules endodermiques encore visibles à l’extérieur et dont le diamètre se réduit progressivement. Le blastopore prend enfin la forme d’une fente blastoporale verticale lorsque l’invagination est achevée. Cette fente correspond à l’anus chez les Urodèles.
La formation et l’évolution du blastopore sont le résultat d’un mouvement combiné d’élongation et de recouvrement des tissus de l’hémisphère animal (épibolie) et de la disparition passive des cellules chargées en vitellus de l’hémisphère végétatif (embolie). Les mouvements de l’hémisphère végétatif provoquent une modification du centre de gravité, et un basculement de l’embryon sur la face ventrale. L’axe animal végétatif devient presque horizontal.
Mouvements morphogénétiques à la gastrulation
Les tissus situés sous la limite de l’ectoblaste vont passer à l’intérieur. Les mouvements sont complexes. Élongation des tissus de l’hémisphère animal, ectoblaste et mésoblaste, l’allongement des tissus du mésoblaste se poursuivant encore à l’intérieur, après son involution. L’élongation de l’ectoblaste lui permet de recouvrir activement par épibolie, la totalité de l’embryon. Le résultat de ces mouvements est, au stade du bouchon vitellin, la formation d’un germe à deux feuillets; l’un, externe ou ectoderme, l’autre interne, composite avec une voûte dorsale mince de mésoderme et un plancher massif d’endoderme. Le feuillet interne limite une cavité nouvelle, l’archentéron, qui s’ouvre au niveau d’un blastopore qui peut se fermer pour s’ouvrir plus tard et former l’anus en une aire dépourvue de mésoderme.
Simultanément, à la limite entre endoderme et mésoderme entourant l’archentéron, une discontinuité se crée. Il y a divergence du matériel mésodermique des lames latérales qui s’étale à droite et à gauche puis vers le bas entre ectoderme et endoderme, tandis que les parois latérales de l’endoderme convergent et tendent à se rejoindre dorsalement pour délimiter l’archentéron. Le mouvement s’achève dans la neurula. Trois feuillets emboîtés se mettent ainsi en place, l’ectoderme, qui s’épaissit sur la face dorsale, le mésoderme et l’endoderme. Dans le mésoderme, la couche axiale va s’isoler progressivement, le mésoderme précordal se dissocie sous l’ectoderme et la future région céphalique.
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Neurulation
Extérieurement, on note un allongement dans le sens antéro-postérieur et un aplatissement de l’embryon dans la région dorsale, qui délimite la plaque neurale en forme de raquette. Celle-ci se creuse en gouttière, se referme d’abord au niveau médian puis s’isole, formant le tube nerveux. Des épaississements latéro-dorsaux répétés au niveau du tronc sont la manifestation de la différenciation des somites. La zone dorsale de l’ectoderme, en contact étroit avec le mésoderme se différencie en neuroblaste sous l’influence inductrice de ce dernier. Les bords latéraux de l’aire aplatie de la plaque neurale forment les bourrelets médullaires. Leur partie la plus externe forme les crêtes neurales. La fusion des bourrelets dans le plan de symétrie de l’embryon isole un tube nerveux du restant de l’ectoderme. Celui-ci n’est plus alors constitué que par de l’épiblaste qui recouvre la totalité de l’embryon et d’où s’isoleront plus tard des placodes sensorielles.
Dans le mésoderme, les somites s’individualisent. Leur nombre varie suivant l’espèce. Ce sont des masses de mésoderme paires, situées de part et d’autre de la corde qui est axiale. Ils forment une structure répétitive qui se différencie en arrière du niveau de la vésicule céphalique dans le sens antéro-postérieur. La corde s’isole en un cylindre de cellules turgescentes. Le mésoderme précordal s’étale sous la vésicule céphalique. Les lames latérales se creusent d’une cavité ou cœlome qui est à l’origine de la cavité générale. Le feuillet externe est la somatopleure, le feuillet interne la splanchnopleure. Entre les lames latérales et les somites, des zones d’étranglement constituent les pièces intermédiaires qui s’isoleront des somites mais restent en communication avec la cavité cœlomique. L’endoderme achève son mouvement de fermeture dorsale.
Xenopus : Un Modèle d'Étude Privilégié
Les œufs d’amphibiens, un modèle d’étude très utilisé dans la biologie du développement. Il est rare d’observer dans la nature aussi facilement les premiers stades du développement que chez les amphibiens. Chez la plupart des animaux, dont l’espèce humaine, cette évolution se fait à l’abri des regards, ou les œufs sont si petits qu’on ne peut pas les observer sans instruments. A l’aide des œufs d’amphibiens, une loupe suffit à observer comment un œuf fécondé se divise et s’organise. La transparence de ces œufs permettent d’en suivre l’évolution quotidienne. On distingue tout d’abord la division de l’ovocyte en 2, puis 4, puis 8 cellules. Ces divisions continuent à s’opérer et en même temps, elles s’organisent peu à peu et forment une larve. Avec un peu de chance, on peut observer le moment où la larve se libère de son enveloppe gélatineuse et se lance dans la vie sous la forme d’un minuscule têtard encore dépendant pendant plusieurs jours des réserves vitellines qu’il contient.
C’est parce que les œufs d’amphibiens sont de grandes tailles, transparents, très nombreux lors d’une ponte qu’ils ont été historiquement très utilisé au début de la biologie du développement. Ainsi le développement de l’embryon précoce est facilement suivi. Leur développement est rapide et sa progression peut être modulée par la température selon les besoins de l’expérimentateur (en évitant des changements trop violents cependant, notamment lors de la gastrulation car cela peut amener à des malformations).
Deux espèces de Xenopus sont particulièrement utilisées dans la recherche :
- Xenopus laevis : Cette espèce produit de gros embryons, idéaux pour la microchirurgie embryonnaire, l’analyse de la surexpression des gènes et les études biochimiques.
- Xenopus tropicalis : En tant qu'organisme diploïde, Xenopus tropicalis facilite les études de perte de fonction. Bien que ses ovocytes et embryons soient plus petits que ceux de Xenopus laevis, son génome présente une conservation importante avec l'Homme, contenant des orthologues pour environ 79 % des gènes identifiés dans les maladies humaines.
Techniques de manipulation génétique chez Xenopus
L’expression des gènes dans les embryons de xénope peut être facilement manipulée à l’aide de microinjections d’ARNm et d’oligonucléotides morpholino antisens (MO) pour un gain ou une perte de fonction, respectivement.
- Morpholinos (MO): Les morpholinos antisens sont utilisés pour inhiber l'expression de gènes spécifiques. Par exemple, l'inhibition de l'expression de Bmp2, Bmp4 et Bmp7 par des morpholinos antisens provoque une dorsalisation et des troncatures postérieures des embryons de xénope.
- CRISPR/Cas9: La technique CRISPR/Cas9 peut être utilisée pour créer des mutations gain ou perte-de-fonction ou générer des lignées rapportrices.
Applications de Xenopus dans la recherche
Outre les méthodes perte- et gain-de-fonction efficaces et peu coûteuses, Xenopus présente des avantages pour l’analyse comparative des structures. En effet, l’injection d’une seule cellule de l’embryon à deux cellules peut cibler le côté gauche ou droit de l’embryon. En utilisant des traceurs fluorescents (GFP) ou enzymatiques (β-galactosidase), on peut facilement détecter le côté injecté de l’embryon et le comparer au côté non injecté. De telles manipulations sont très utiles car elles fournissent un contrôle interne chez le même animal pour chaque expérience. En plus de l’injection au stade 2 cellules, les embryons de xénope ont une carte du destin cellulaire bien définie pour chaque système organique. Cela permet des injections ciblées, où l’expression des gènes peut être modifiée dans des organes ou des tissus spécifiques. Les embryons de xénope et notamment de Xenopus laevis qui sont plus gros se prêtent très bien à des expériences de microchirurgie embryonnaire.
Fait important, parce que les premiers stades de clivage sont holoblastiques (par opposition aux clivages méroblastiques chez les embryons de poule ou de poisson zèbre), le vitellus (réserves énergétiques) est distribué à toutes les cellules, de sorte que les explants ne nécessitent aucune nutrition supplémentaire car ils peuvent survivre en utilisant les nutriments stockés dans les cellules. Le tissu disséqué se développe et se différencie dans une simple solution saline. Le xénope est aussi utile pour produire des cultures cellulaires de cellules pluripotentes : les cellules de la calotte (ou coiffe) animale, prélevées sur des blastulas. Sans intervention, ces cellules finissent par se développer en petits organoïdes épidermiques.
Exemples d'études utilisant Xenopus
- Analyse du transcriptome d’explants de calotte animale : Cette technique permet d'étudier les changements de l'expression des gènes dans différentes conditions, comme l'induction neurale ou épidermique.
- Mise en évidence de CSF chez le xénope : Le xénope a permis de mettre en évidence le CSF (Cytostatic Factor), qui maintient l’ovocyte en arrêt de cycle en métaphase II jusqu'à la fécondation.
Techniques d'Observation et de Marquage
Un marquage à l’aide de colorants vitaux des différentes parties de la surface de la blastula fut la première technique qui ait permis de suivre les mouvements cellulaires à la gastrulation et de reconstituer a posteriori une carte du devenir présomptif des différentes parties de la blastula avant la gastrulation: la carte des territoires présomptifs. Il suffisait d’utiliser de minuscules fragments d’agar agar imprégnés de rouge neutre ou de sulfate bleu de Nil qui étaient appliqués à la surface de la blastula immobilisée dans une logette de paraffine et convenablement orientée. On suivait ensuite le cheminement des marques colorées ainsi obtenues, ce qui permettait de préciser la chronologie, le sens et l’importance des mouvements des tissus pendant la gastrulation. D’autre part, on identifiait les différentes ébauches d’organes où se retrouvent les cellules colorées. La carte des territoires ainsi dressée par Vogt reste très commode pour décrire les mouvements morphogénétiques.
Cependant, on ne peut plus considérer qu’elle indique très exactement la destinée des cellules d’un territoire. En effet, ce marquage n’est pas assez précis; un certain degré de mélange cellulaire se produit à la frontière des territoires, dès la segmentation, puis à la gastrulation, ce que les marques colorées ne permettent pas de repérer. Des travaux réalisés sur diverses espèces, telles que le pleurodèle (Delarue et coll., 1992), le xénope (Dale et Slack, 1987), utilisent des colorants vitaux marqués à la fluorescéine ou à la rhodamine, qui sont injectés à des stades précoces du développement, par exemple dans chacun des blastomères d’une morula au stade 32 cellules du xénope, choisie pour la régularité de sa segmentation. Ils retrouvent à la neurula la position de chacune des cellules filles issues de chaque blastomère, ce qui leur permet de rétablir leur filiation jusqu’à la morula. Il existe certes une relation avec la cartographie classique, mais on constate aussi qu’une fraction des cellules dérivées des blastomères bien identifiés s’est trouvée intégrée, au stade neurula, dans des ébauches d’organes que l’analyse classique ne prévoyait pas.
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