Introduction
La fécondation, étape cruciale de la reproduction sexuée, est un processus complexe impliquant la fusion d'un spermatozoïde et d'un ovocyte. Cette fusion déclenche une série d'événements moléculaires et cellulaires qui aboutissent à la formation d'un zygote, la première cellule du nouvel organisme. Parmi ces événements, la réaction corticale joue un rôle essentiel dans la prévention de la polyspermie, c'est-à-dire la pénétration de plusieurs spermatozoïdes dans l'ovocyte, un phénomène qui entraînerait des anomalies chromosomiques et le développement anormal de l'embryon. Les granules corticaux, des vésicules sécrétoires présentes dans le cortex ovocytaire, et les protéases qu'ils contiennent, sont des acteurs clés de cette réaction corticale.
La matrice extracellulaire et l'adhérence cellulaire
Chez les organismes pluricellulaires, les cellules restent solidaires après la fin de la mitose grâce à l'adhérence cellule-cellule et à l'adhérence cellule-matrice extracellulaire (MEC). La MEC est un réseau macromoléculaire tridimensionnel de glycoprotéines qui permet l'attachement cellulaire et agit comme un signal pour les cellules par ses propriétés mécaniques (mécanotransduction) et biochimiques. Elle sert également de réservoir pour d'autres molécules de signalisation. La MEC interagit de manière dynamique avec les cellules pour réguler leur comportement, et les cellules réagissent en modifiant la matrice et donc l'environnement local.
Le collagène, constituant majeur de la MEC, est constitué de longues chaînes polypeptidiques avec des répétitions de triplets Glycine-Proline-HydroxyProline. Trois chaînes alpha forment une triple hélice stabilisée par des liaisons hydrogène. Les fibres de collagène sont produites par les fibroblastes. La synthèse d'hydroxyproline à partir de la proline est réalisée par la prolyl-hydroxylase, qui nécessite de l'acide ascorbique (vitamine C) pour son activité.
La fibronectine, un dimère de grosses chaînes polypeptidiques liées par des ponts disulfures, possède des domaines de fixation au collagène, aux sulfates d'héparanes et aux intégrines, les récepteurs cellulaires à la MEC. La laminine, un gros complexe de trois longues chaînes arrangées en croix, se trouve dans les lames basales et possède des sites de liaison avec les intégrines et les protéoglycanes.
Les glycosaminoglycanes (GAGs), de longues chaînes d'oses formées par répétition de deux résidus glucidiques, présentent beaucoup de charges négatives et attirent l'eau, conférant une résistance à la compression. Ils sont généralement associés de manière covalente à des protéines centrales pour former les protéoglycanes. Les protéoglycanes agissent comme corécepteurs pour les voies Wnt, FGF, Hedgehog et BMP et peuvent être clivés ou éliminés de la membrane et de la matrice extracellulaire, modifiant la concentration et la disponibilité du ligand.
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La diversité des molécules et l'épissage alternatif
Toutes ces molécules présentent une très grande diversité, d'origine génétique (chez l'Homme, il y a 20 chaînes de collagène α différentes) et grâce à des épissages alternatifs. Il en résulte des isoformes spécifiques des tissus. C'est le cas de la fibronectine, dont le pré-ARNm subit un épissage différent dans les fibroblastes et les hépatocytes.
Les tissus squelettiques et leur formation
Les tissus squelettiques, qui se développent généralement à partir du mésoderme (sauf dans la tête où les cellules de crêtes neurales font une contribution majeure), ont un rôle de support et de soutien. Les os sont constitués de MEC minéralisée par l'hydroxyapatite et servent de réserve essentielle de calcium. Les cellules sécrétant la MEC à l'origine des os sont les ostéoblastes, qui deviennent des ostéocytes une fois que la MEC autour d'eux est minéralisée. Le cartilage est constitué de MEC non minéralisée, riche en collagène de type II, en GAG et en protéoglycanes.
Les granules corticaux : structure et formation
Les granules corticaux sont des vésicules sécrétoires (de 0,2 à 0,6 µm de diamètre) présentes dans le cytoplasme cortical des ovocytes de nombreuses espèces, notamment les oursins, les anoures et certains mammifères. Ils proviennent de l'appareil de Golgi et contiennent des glycoprotéines, des glycosaminoglycanes et des protéases.
La formation des granules corticaux a lieu pendant les premiers stades de la croissance des ovocytes. Chez l'humain, le singe, le hamster et le lapin, les granules corticaux sont établis une fois que le follicule ovarien est multicouche. Chez le rat et la souris, des granules corticaux ont été observés plus tôt dans le développement du follicule, alors que le follicule ovarien ne comporte qu'une seule couche. Au cours des premiers stades de la croissance des ovocytes, le complexe de Golgi grossit, prolifère et produit de petites vésicules qui migrent vers la région sous-corticale de la cellule. Ces petites vésicules vont fusionner les unes avec les autres pour former des granules corticaux matures, qui sont ainsi établis comme des entités séparées de l'appareil de Golgi. Chez certains organismes, comme chez le hamster, la vésicule sécrétée du Golgi peut fusionner avec une vésicule sécrétée du réticulum endoplasmique rugueux pour finalement former un granule cortical. Chez les mammifères, l'ovocyte produit et transfère en continu des granules corticaux jusqu'à l'ovulation.
Distribution des granules corticaux
À la suite de la translocation, les granules corticaux sont répartis uniformément dans le cortex de l'ovocyte. Cependant, il a été observé chez les rongeurs que certains granules corticaux sont réarrangés en laissant un espace entre les granules corticaux restants. Cet espace est appelé domaine libre de granules corticaux (DLGC) et a été observé dans les deux régions de fuseau méiotique de la cellule au cours de la métaphase I et de la métaphase II de la méiose. Des DLGC n'ont pas été observés dans les ovocytes félins, équins, bovins, porcins ni humains. Des études sur les ovocytes de rongeurs suggèrent que certains granules corticaux subissent une redistribution et / ou une exocytose tout au long du cycle méiotique, établissant ainsi les DLGC. De plus, certains événements exocytotiques de granules corticaux pré-fécondation interviennent dans le sillon de clivage de la cellule simultanément à la formation de corps polaire.
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Un assortiment d'hypothèses existent concernant la fonction biologique des DLGC et l'exocytose des granules corticaux avant la fécondation. Par exemple, la formation des DLGC peut être le mécanisme utilisé par l'ovocyte pour retenir davantage de granules corticaux en vue d'une utilisation future plutôt que de les perdre au profit des corps polaires lorsque les corps polaires extrudent de la cellule. Certains granules corticaux libérés provenant d'une région proche des fuseaux méiotiques, les chercheurs ont également émis l'hypothèse que les granules corticaux libérés pourraient modifier la matrice extracellulaire de l'ovocyte de sorte que les spermatozoïdes ne puissent pas se lier dans cette région.
La réaction corticale : un mécanisme anti-polyspermie
Lors de la pénétration du spermatozoïde, ces vésicules déversent leur contenu par exocytose dans l'espace périovocytaire. Une enzyme digère les liaisons entre les membranes vitelline et plasmique de manière à permettre une entrée d'eau dans l'espace périovocytaire. La membrane vitelline est rendue plus résistante et devient la membrane de fécondation.
La réaction corticale est l'exocytose des granules corticaux de l'ovule. Les granules corticaux sont des vésicules sécrétoires situées juste en dessous de la membrane plasmique de l'ovule. Lorsque le sperme fertilisant entre en contact avec la membrane plasmique de l'ovule, le calcium est libéré des sites de stockage dans l'ovule, ce qui entraîne une augmentation de la concentration intracellulaire de calcium libre. Cela déclenche la fusion des membranes des granules corticales avec la membrane plasmique de l'ovule, libérant ainsi le contenu des granules dans l'espace extracellulaire. La fusion commence près de la zone de contact des spermatozoïdes, puis, lorsque la vague de libération de calcium existe autour de l'ovule, une vague de résultats de fusion des granules corticaux est produite. Le contenu des granules varie selon les espèces et ils ne sont pas connus dans leur intégralité.
Les granules corticaux contiennent des protéases qui coupent les protéines d'attache périvitelline, des peroxydases qui durcissent l'enveloppe vitelline et des glycosaminoglycanes qui attirent l'eau dans l'espace périvitellin, ce qui entraîne son expansion et sa formation de la couche hyaline. Le déclencheur de l'exocytose des granules corticaux est la libération d'ions calcium du réticulum endoplasmique lisse cortical en réponse à la liaison du sperme à l'ovule.
Chez la plupart des animaux, la matrice extracellulaire présente autour de l'œuf est l'enveloppe vitelline qui devient la membrane de fécondation à la suite de la réaction corticale. Chez les mammifères, toutefois, la matrice extracellulaire modifiée par la réaction corticale est la zone pellucide. Cette modification de la zone pellucide est appelée réaction de zone. Bien que hautement conservée dans le règne animal, la réaction corticale montre une grande diversité d'espèces. Bien que l'on ait beaucoup appris sur l'identité et la fonction du contenu des granules corticaux chez l'oursin hautement accessible, on en sait peu sur le contenu des granules corticaux chez les mammifères.
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La réaction corticale dans l'ovule est analogue à la réaction acrosomique dans le sperme, où l'acrosome, une vésicule de sécrétion spécialisée homologue des granules corticaux, est fusionné avec la membrane plasmique du spermatozoïde pour libérer son contenu qui dégrade le corps dur de l'ovule.
Les protéases ovocytaires et la modification de la zone pellucide
Chez les mammifères, la réaction corticale entraîne la libération d'enzymes protéolytiques qui modifient la zone pellucide, la matrice extracellulaire entourant l'ovocyte. Ces protéases clivent notamment les protéines ZP2 et ZP3, les récepteurs du sperme, empêchant ainsi la liaison d'autres spermatozoïdes. L'ovastacine, une protéase libérée par les granules corticaux, est responsable du clivage de ZP2, rendant la zone pellucide imperméable aux spermatozoïdes. La liaison du spermatozoïde à ZP3 peut également induire des changements de conformation de la zone pellucide, altérant ses propriétés mécaniques et empêchant la polyspermie.
Le rôle du calcium dans l'activation ovocytaire
L'activation ovocytaire désigne l'ensemble des modifications moléculaires, structurales et morphologiques qui caractérisent la transition entre ovocyte et embryon. Avant sa fécondation, l'ovocyte mature est bloqué au stade de métaphase de deuxième division méiotique. La sortie de méiose repose en partie sur l'inactivation du MPF (M-phase promoting factor), un hétérodimère protéique constitué de la kinase cycline-dépendante CDK1 (cyclin dependent kinase 1) et de la cycline B. Les études menées utilisant le modèle murin ont montré que l'augmentation de la concentration intracellulaire en ions calciques permet l'activation de la kinase CaMKII (protéine kinase II calmoduline dépendante) qui phosphoryle la protéine Emi2 (early mitotic inhibitor 2), ce qui entraîne sa dégradation. Il y a ainsi levée de l'inhibition exercée par Emi2 sur l'APC (anaphase promoting complex), provoquant la dégradation de ses substrats, sécurine et cycline B. La sécurine se détache de la protéase séparase qui devient ainsi active et clive les cohésines qui maintenaient associées les chromatides maternelles, permettant la séparation des chromatides sœurs (assurant une ploïdie correcte de l'embryon) et l'extrusion du deuxième globule polaire. La dégradation de la cycline B permet l'inactivation de la kinase CDK1 qui maintenait l'ovocyte au stade métaphase II. En conséquence, l'ovocyte sort de méiose et forme les pronoyaux femelle et mâle.
L'existence d'un facteur spermatique d'activation ovocytaire
Chez les mammifères, l'augmentation de calcium intracellulaire qui est déclenchée par la fécondation est réalisée par une série d'oscillations calciques survenant dans l'ovocyte juste après la fusion gamétique. Ces oscillations seraient déclenchées par un facteur cytosoluble d'origine spermatique, libéré dans le cytoplasme ovocytaire au moment de la fusion des gamètes. Les Anglo-Saxons utilisent le terme SOAF pour sperm oocyte-activating factor, mais l'identité de ce facteur est restée élusive durant de nombreuses années. En 2002, on a proposé la phospholipase C Zeta (PLCζ), une protéine qui chez les mammifères est exclusivement exprimée dans les spermatozoïdes. Il a ainsi été démontré que l'injection dans l'ovocyte de souris d'ARN complémentaire codant pour la PLCζ générait des oscillations calciques similaires à celles observées lors de la fécondation par un spermatozoïde. Le rôle de la PLCζ a depuis été confirmé par d'autres groupes de recherche indépendants et en particulier par Kouchi et al. Ces auteurs ont utilisé la protéine PLCζ recombinante pour générer avec succès des oscillations calciques dans des ovocytes murins. La PLCζ appartient à la famille des phospholipases qui hydrolysent le phosphatidylinositol-4,5-diphosphate (PIP2). Le PIP2 est un phospholipide constituant des membranes cellulaires qui joue le rôle de substrat pour plusieurs protéines importantes de la signalisation cellulaire. PIP2 est hydrolysé en diacylglycérol (DAG) et en inositol triphosphate (IP3). Le DAG reste ancré à la membrane ovocytaire tandis que l'IP3 diffuse dans le cytoplasme cellulaire. La liaison de l'IP3 à son récepteur permet la libération d'ions calciques stockés dans le réticulum endoplasmique. Le récepteur de l'IP3 est sensible au calcium et se referme lorsque le calcium intracellulaire est trop élevé.
Le rôle fondamental de la protéine spermatique PLCζ dans la fécondation a été confirmé dans des études cliniques qui rapportent son absence ou l'existence de mutations entraînant sa non fonctionnalité chez des patients infertiles. L'ajout d'ARN complémentaires de PLCζ permet de rétablir les oscillations calciques dans les ovocytes murins injectés avec les spermatozoïdes de patients infertiles qui ne comportent pas de PLCζ. Récemment, un second candidat a été proposé par Aarabi et al. Le rôle de la protéine spermatique PAWP (post-acrosomal WW-domain binding protein) dans la fécondation avait d'abord été suggéré par Wu et al. L'étude d'Aarabi et al. a suggéré que PAWP pourrait générer des oscillations calciques par une voie de signalisation qui reste encore à élucider. Cependant cette hypothèse reste controversée. En effet, d'autres chercheurs n'arrivent pas à obtenir de telles oscillations calciques avec PAWP. Des études cliniques seront sans doute nécessaires pour confirmer ou infirmer le rôle joué par cette protéine.
Implications thérapeutiques et aide à l'activation ovocytaire
L'adjonction d'un ionophore calcique dans le milieu de culture embryonnaire est une méthode utilisée dans de nombreux essais cliniques qui a démontré son efficacité. Ainsi, l'utilisation transitoire d'A23187 (un antibiotique également connu sous le nom de calcimycine) provoque une augmentation transitoire de la concentration intracellulaire d'ions calciques (Ca2+) dans les ovocytes, permettant la sortie de méiose de cet ovocyte et la fécondation, induisant l'activation de la transduction du signal et mimant l'action de la PLCζ sur celui-ci. Cette fonction est appelée « déclencheur ». Néanmoins, il existe une différence notable de la signalisation calcique induite par ce procédé comparée au processus physiologique. En effet, l'ionophore calcique provoque une entrée massive de calcium et une augmentation en plateau de la concentration en calcium intracellulaire dans l'ovocyte jusqu'au rinçage de la molécule, contrairement au processus physiologique qui implique l'induction d'oscillations calciques pouvant perdurer après l'expulsion du deuxième globule polaire.
Malgré ces réserves, de nombreuses équipes étrangères proposent déjà aux couples pris en charge dans leur centre d'assistance médicale à la procréation, une assistance à l'activation ovocytaire. Cette aide à l'activation ovocytaire, couplée à l'ICSI, augmente les taux de fécondation de façon significative chez les couples présentant des anomalies de fécondation.
La zone pellucide : une matrice extracellulaire protectrice
Chez les Mammifères, la zone pellucide est une matrice glycoprotéique qui entoure les ovocytes et a une épaisseur moyenne de 17 µm. Elle est essentielle pour la fécondation (plus précisément pour la reconnaissance des gamètes et pour la prévention de la polyspermie), et pour la protection des embryons précoces avant l’implantation. La zone pellucide est composée essentiellement de glycoprotéines appelées ZP1 à ZP4. Chaque protéine ZP est un polypeptide qui est glycosylé de manière hétérogène avec des oligosaccharides liés à l’asparagine (N-) et à la sérine/thréonine (O-) qui, dans certains cas, sont sialylés et sulfatés. Chez certains mammifères, tels que le chat, la vache, le chien et le porc, ZP1 n’est pas présent et sa fonction est complètement remplacée par ZP4. Chez la souris, ZP4 n’est pas présent puisqu’il est codé par un pseudogène qui n’est pas exprimé lors de l’ovogenèse. ZP1 et ZP4 proviennent de la duplication récente d’un gène ancestral et cela est suivi des vicissitudes habituelles dans ce cas avec de possibles transformations en pseudogènes ou délétion par redondance fonctionnelle. ZP2 est assez apparenté à ZP1 et ZP4. Chez la souris, le knock-out ciblé soit du gène codant ZP2 soit du gène codant ZP3 empêche le développement d’une zone pellucide, conduisant à la stérilité.
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